RAF信号通路

目的 探讨PUN30119生产商生长抑素联合低分子肝素对高脂血症性急性胰腺炎(HLAP)患者血液高凝状态、降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)及肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的影响。方法 以平顶山市第二人民医院宝丰分院2020年1月至2023年1月收治的66例HLAP患者为研究dermatologic immune-related adverse event对象，根据治疗方案将患者分为参照组(33例)和联合组(33例)。参照组采用生长抑素治疗，联合组采用生长抑素联合低分子肝素治疗。比较两组临床疗效、临床症状改善时间、治疗前后血液流变学指标(红细胞聚集指数、血浆黏度、全血低切黏度、全血高切黏度)、血清RAAS指标[血管紧张素-Ⅱ(Ang-Ⅱ)、肾素(E)、醛固酮(ALD)]、血清PCTVX-765试剂、CRP、热休克蛋白70(HSP70)、热休克蛋白27(HSP27)水平。结果 联合组临床总有效率(96.97%)高于参照组(75.76%),差异有统计学意义(P<0.05);联合组肠道功能恢复时间、血淀粉酶恢复正常时间、腹膜炎体征及腹痛消失时间短于参照组，差异均有统计学意义(P<0.05);治疗后联合组红细胞聚集指数、全血低切黏度、全血高切黏度及血浆黏度降低幅度大于参照组，差异均有统计学意义(P<0.05);治疗后联合组血清E、Ang-Ⅱ、ALD水平低于参照组，差异均有统计学意义(P<0.05);与治疗前相比，各组治疗后血清PCT、CRP、HSP70、HSP27水平明显降低，其中联合组降低幅度更为显著，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 生长抑素联合低分子肝素治疗HLAP疗效显著，能够改善血液高凝状态，减轻炎症反应，有利于患者病情恢复。

研究背景:多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)是恶性程度最高的颅内肿瘤,占原发性脑肿瘤的17%,全球每年约有10万名被诊断为高级别或恶性GBM患者,其中位生存期小于1年。目前对GBM的常规治疗方案为手术切除与放化疗结合。尽管手术切除、放疗、化疗、免疫疗法和光热治疗(Photothermal therapy,PTT)等对GBM治疗具有一定疗效,但GBM患者的预后仍较差,其原因主要与GBM细胞增殖迅速造成术后复发,GBM细胞对化疗产生耐药性以及某些药物难以穿越血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)和血肿瘤屏障(Blood tumor barrier,BTB)等密切相关。大量临床和基础研究均证实单一治疗策略常诱导GBM产生抗性,很难达到最佳治疗效果。因此,联合肿瘤靶向治疗和PTT的方案对治疗GBM具有潜在的临床应用前景。石墨炔(Graphdiyne,GDY)是迄今为止发现的唯一含有sp杂化碳原子的碳同素异构体,虽然近年来GDY在能源储存和催化等领域的应用研究取得了一定的进展,但与石墨烯等二维碳纳米材料相比,GDY尚未被深入研究和广泛应用。值得关注的是,GDY是一种具有载药能力和可修饰性的光热材料,通过π-π堆叠共轭吸附含有芳香烃或类芳香烃结构的小分子,具备肿瘤靶向和PTT治疗的潜力。研究表明,受体—配体识别是肿瘤靶向治疗的关键环节,其中低密度脂蛋白受体相关蛋白-1(Low-density lipoprotein receptor-related protein-1,LRP-1)是一种高表达于脑毛细血管和肿瘤新生血管内皮细胞以及GBM细胞的膜蛋白受体,利用LRP-1的配体—受体相关蛋白(Receptor-associated protein,RAP)作为修饰纳米载体的功能性靶头,能有效递送药物透过BBB增加GBM组织中药物含量,提示以RAP修饰的纳米载体递送GBM靶向治疗药物具有可行性。铁死亡(Ferroptosis)是一种铁依赖的以氧化损伤为特征的细胞死亡方式,谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase,GPX4)是参与调控铁死亡的重要分子,能通过下调细胞脂质过氧化反应抑制铁死亡,FIN56是一种特异性的GPX4抑制剂,通过诱导GPX4降解而使细胞产生大量活性氧(Reactive oxygen species,ROS),导致线粒体结构损坏和细胞能量代谢紊乱,最终促进铁死亡。基于此,本论文以GDY为药物载体和光热转换材料,利用FIN56诱导铁死亡的特性和RAP靶向性能,构建具有透过BBB与BTB,和GBM靶向递药能力以及光热转换性能的纳米载药体系,评价该体系联合PTT对GBM细胞铁死亡的促进作用,并对其分子机制进行了深度解析。材料与方法:采用三步法组装GDY、FIN56和RAP以制备GDY-FIN56-RAP(GFR)自组装纳米载药体系。应用透射电子显微镜和原子力显微镜表征纳米载药体系形态、尺寸和厚度,动态光散射表征纳米载药体系水合粒径分布,红外成像仪表征纳米载药体系光热性能。在体外细胞实验中,应用CCK8法检测纳米载药体系对GBM细胞活力的影响,Ed U法检测纳米载药体系对GBM细胞增殖的影响,活/死细胞染色检测纳米载药体系对GBM细胞杀伤作用,Western blot检测铁死亡与铁代谢相关蛋白水平,流式细胞术检测细胞ROS水平,生化试剂盒检测细胞内脂质过氧化产物丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)含量,透射电子显微镜检测线粒体形态,体外BTB模型检测GFR穿透BTB能力。在体内实验中,选用4周龄雌性裸鼠,将表达荧光素酶的LN229细胞接种于右脑纹状体,构建原位GBM模型小鼠。应用质谱成像显微镜(i MScope)检测GFR穿过BBB和BTB的能力和靶向递药能力。为评估GFR体内抗GBM效果,运用Western blot检测GPX4蛋白表达水平,流式细胞术检测肿瘤组织ROS含量,生化试剂盒检测组织MDA和GSH含量,免疫荧光检测8-羟基鸟苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine,8-OHd G)水平和分布,小动物体内成像系统(In vivo imaging system,IVIS)监测GBM生长情况。结果:(1)GDY-RAP纳米片,厚度为14.5 nm,水合粒径集中分布于220 nm,zeta电位约为15 m V。(2)随着FIN56/GR投料比的增加,GFR载药量高达47.16±3HDAC抑制剂.18%,在投料比增加至3时,载药量进入体系期,包封率从68.25±0.72%降至18±2.28%。(3)GFR纳米载药体系为片状结构,厚度为16.9 nm,水合粒径集中分布于255 nm,zeta电位约为9 m V。(4)808 nm激光照射使GFR分散溶液的温度以剂量依赖的方式显著升高,4次激光开关循环显示GFR具有良好的光热稳定性。808nm激光照射显著诱导GFR在酸性条件下释放更多的FIN56。(5)在LN229和T98G细胞中,FIN56以剂量依赖的方式诱导细胞活力降低。GFR显著降低细胞PUN30119核磁活力,GFR联合808 nm激光照射进一步降低细胞活力。(6)808 nm激光照射促进GFR诱导的GBM细胞死亡。(7)GFR纳米载药体系通过降低GPX4蛋白水平,促进细胞ROS水平升高,诱导GBM细胞氧化-还原失衡。(8)808 nm激光照射促进GFR诱导的GBM细胞铁死亡。(9)在8 h内GFR不显著破坏体外BTB屏障结构。(10)GFR有效透过体外BTB模型,降低GBM细胞GPX4水平。(11)i MScope结果显示,GFR纳米载药体系能将FIN56快速并特异性的递送至GBM组织。(12)FIN56在体内的生物分布显示,GFR能高效递送FIN56至GBM组织,并延长FIN56在GBM组织内的滞留时间。(13)GFR在体内保持良好的光热性能,808 nm激光照射诱导模型小鼠肿瘤部位温度升高。(14)GFR纳米载药体系联合808 nm激光照射抑制GBM生长。(15)GFR纳米载药体系联合808 nm激光照射延长荷瘤小鼠寿命。(16)GFR、GR联合808 nm激光照射和GFR联合808 nm激光照射显著改善荷瘤小鼠的神经功能和运动能力。(17)GFR治疗联合近红外光照射,促进GBM组织内GPX4降解和线粒体损伤。(18)GFR纳米载药体系联合808 nm激光照射促进模型小鼠GBM铁死亡,更显著的抑制GBM生长并延长小鼠寿命。(19)实验中制备的纳米载药体系在给药剂量下未造成显著溶血,对小鼠主要脏器未见明显病理损伤。结论:本研究首次构建了装载FIN56的GBM靶向石墨炔纳米载药体系GFR;证实了GFR通过其靶头RAP与LRP-1特异性结合将GFR靶向递送入脑直至GBM细胞,进而杀伤GBM细胞;阐明了GFR联合PTT治疗通过降低GBM细胞内GPX4水平促进细胞铁死亡的分子机制。研究结果不仅为GFR对GBM的潜在临床应用奠定基础,而且为进一步拓展GDY在Water microbiological analysis生物医学领域的应用提供科学依据。

目的本研究STM2457运用公共数据库对肿瘤生物学数据进行分析,并结合实验验证,探讨SLC7A11在肾透明细胞癌中的表达与临床相关性及其临床意义。方法通过癌症基因组图谱(TCGA)数据库和GEO数据库中下载cc RCC患者的转录组数据和临床数据,使用R软件v4.2.1对数据进行整理。分析SLC7A11基因在cc RCC中的差异表达、预后价值、富集分析及免疫浸润,并构建基于SLC7A11表达1、3、5年的预测模型。并结合收集的临床样本进行实时荧光定量PCR(q RT-PCR)及免疫组化实验进行验证。结果公共数据库分析结果显示:SLC7A11基因在cc RCC组织较正常组织表达升高(P<0.001),且SLC7A11基因的表达与性别、T分期和远处转移密切相关(P<0.05)。生存分析显示SLC7A11基因的表达与cc RCC患者的总生存期(P=0.003)显著相关,并且单因素和多因素COX回归分析显示SLC7A11基因是cc RCC患www.selleck.cn/products/VX-765者预后的独立危险因素(P<0.001)。基于SLC7A11的表达与患者的年龄、Wang’s internal medicine性别、肿瘤分期、T分期、淋巴结浸润和远处转移构建的诺莫图,其1,3,5年OS的Calibration校准曲线与理想模型拟合度良好,且模型的C-index指数为0.778,并且通过80例患者临床资料进行验证,与预测模型拟合较好。富集分析结果表明,在cc RCC中SLC7A11的表达与细胞周期密切相关。免疫分析显示,在SLC7A11与多种免疫细胞的浸润相关,表明肿瘤免疫微环境可能在cc RCC的发展过程中发挥了作用。RT-PCR实验结果显示SLC7A11基因在cc RCC组织中的表达高于癌旁组织。IHC实验结果显示:SLC7A11在cc RCC组织中的表达高于癌旁组织,且SLC7A11表达在细胞膜与细胞质中;SLC7A11的表达与年龄、术前有无症状、病理分级、肿瘤浸润深度(T)及临床分期密切相关(P<0.05);SLC7A11低表达组总生存期更长(P=0.003),SLC7A11表达增加与无进展生存期(P=0.003)显著相关;多因素COX分析SLC7A11是总生存期和无进展生存期的独立预后因素。结论1、SLC7A11在肾透明细胞癌中高表达且与肾透明细胞癌患者的临床病理特征相关;2、SLC7A11高表达提示肾透明细胞癌患者的预后较差。

目的 观察脉冲射频（PRF）联合自体富血小板血浆（PRP）脊神经根周围注射治疗带状疱疹后遗神经痛（PHN）临床效果。方法 选取医院2020年1月-2022年5月收治的78例PHN患者，用随机数字表法将其分为对照组、研究组，各组均39例；对照组接受PRF治疗，研究组接受PRF联合自体PRP治疗；对比两组临床疗效、致痛因子水平、炎性因子水平、睡眠质量及不良反应发生情况。结果 研究组总有效率（92.31%）较对照组（71.79%）高，差异有统计学意义PS-341体内实验剂量（P <0.05）；两组治疗前致痛因子水平、炎性因子水平、睡眠质量对比差异无统计学意义（P> 0Cobimetinib molecular weight.05）；研究组治疗1周，5-HT、MCP-1、PGE2、CRP、IL-6水平均较对照组低，且PSQI评分较对照组低，差异有统计学意义（P <0.05）；组间不良反应发生率（5.13%/2.56%）对比差异无统计学意义（P> 0.05）。结论 PHN患者采用PRF联合自体PRP脊神经根周围注射治疗疗效较好，可降低致痛因子及炎性因子水平，改善睡眠Komeda diabetes-prone (KDP) rat质量，且安全性好。

目的 探讨干预自噬对结直肠癌细胞铁死亡和奥沙利铂(OXA)耐药的影响及分子机制。方法 培养人结直肠癌HCT-8、COLO205、HCT-116、SW620和SW480细胞系,筛选LC3表达适中的HCT-116细胞,检测其与OXA耐药HCT-116/OXA细胞株LC3、p62、Keap1、Nrf2、GPX4蛋白及Fe~(2+)、GSH、MDA的表达差异,并应用自噬和铁死亡干预剂并联合OXA干预HCT-1 16/OXA细胞株,检测LC3、p62、Keap1、Nrf2、GPX4蛋白及Fe~(2+)、GSH、MDA的表达,CCK-8实验检测各组细胞的增殖活性及对OXA的敏感性,平板克隆、Transwell实验检测各组细胞的生长情况和侵袭能力。结果 5组细胞中HCT-1 16细胞的LC3、p62和GPX4均呈中等表达量;与HCT-116细胞相比,HCT-116/OXA细胞对OXA敏感性较低,且p62、Nrf2、GPX4蛋白呈高表达,Lselleck CanagliflozinC3和Keap1呈低表达,Fe~(2+)、GSH、MDA表达水平均增高(P <0.05);自噬激活剂Rapa组及Rapa+Fer-1组较Fer-1组和对照组的LC3、Keap1蛋白及Fe~(2+)、MDA水平均升高,而p62、Nrf2、GPX4蛋白及GSH水平呈低表达,且Rapa+Fer-1组GPX4蛋白、GSH的水平低于Rapa组(P <0.05)。在自噬抑制剂组中,CQ组及CQ+Erastin组与对照组和ErasPF-03084014体外tin组相比其LC3、p62、Nrf2、GPX4蛋白及GSH水平均呈高表达,Keap1蛋白、Fe~(2+)、MDA均呈低表达,而Erastin组GPX4蛋白、GSH表达低于其余三组,Fe~(2+)、MDA含量高于其余三组(P<0.05)。自噬激活剂联合应用OSupervivencia libre de enfermedadXA,Rapa干预组与其余三组相比,其对OXA的化学敏感性高、迁移细胞数量少、细胞增殖活性低;Rapa+Fer-1组对OXA的敏感性低于Rapa组,但高于Fer-1组和对照组(P<0.05)。而Fer-1组与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。自噬抑制剂联合应用OXA,Erastin、CQ+Erastin和CQ三组与对照组相比其细胞活性、迁移能力和克隆形成能力均降低,其中Erastin组最低,而CQ+Erastin组高于Erastin组、低于CQ组(P <0.05)。结论 在结直肠癌中,自噬参与了铁死亡的调节,干预自噬可通过p62-Keap1/Nrf2-GPX4通路调控结直肠癌细胞发生铁死亡,从而逆转OXA耐药。

目的 探讨5-氟尿嘧啶/亚叶酸钙+奥沙利铂+伊立替康(FOLFOXIRI)改良方案姑息化疗治疗中老年晚期胃癌的效果。方法 选取2020年2月至2022年8月本院收治的中老年晚期胃癌患者106例为研究对象，依随机数字法分2组，JQ1体内对照组患者接受XELOX方案治疗；观察组患者接受FOLFOXIRI改良方案姑息化疗治疗，观察2组治疗效果，观察2组血红蛋白、血小核、胃泌素-17、免疫因子(IgG、IgM、IgA、CD_4/CD_8)水平，及并发症发生情况。结果 观察组有效率、疾病控制率均高于对照组(P<Accessories0.05)。治疗后2组免疫反应指标均有所上升，且观察组IgGL、IgM、IgA、CD4/CD8,显著高于对照组(P<0.001)。观察组患者除手足综合征外selleck合成，其他并发症率低于对照组(P<0.05)。结论 中老年晚期胃癌患者，采取FOLFOXIRI改良方案姑息化疗治疗，其治疗效果、病情控制率更为明显，并增强患者免疫功能，且并发症更少，值得临床借鉴。

细VE-822分子式胞遭受着内源外源环境因子的持续性威胁,会影响细胞遗传物质的稳定性并产生各种DNA损伤。据统计,人类的每一个细胞每天会发生大约60000个DNA损伤事件,这些事件可能是由紫外线、电离辐射、植物毒素、有毒试剂以及活性氧自由基等物理或化学因素引起的。若这些损伤得不到及时修复,它们就有可能干扰细胞正常的功能,导致基因组DNA受到损伤,从而增加细胞癌变的可能性,但幸运的是,生物细胞进化出了多种DNA损伤反应应对或修复这些损伤。DNA损伤修复是一种非常复杂的分子网络系统,而参与DNA损伤修复通路的蛋白质被称为DNA损伤修复因子。DNA损伤修复途径可以保持细胞内遗传物质的稳定,它们的功能的正常运转对于细胞来说是至关重要的。目前发现,当细胞内某一种或某几种修复途径出现缺陷时,癌变的风险往往会增加。因此,鉴定新的DNA损伤修复因子并解析其结构与功能,以及完善DNA损伤修复途径等,仍然是现代生命科学领域的研究热点。此外,基于基础理论建立的新的作用靶点的精准鉴定和特异性的抗癌药物的开发也将成为未来生物医学领域的重要方向。有证据表明,PPAN在恶性肿瘤的发展中起作用,PPAN在将来很可能被鉴定为一个新的DNA损伤修复因子。例如:PPAN在Wnt信号上调的小鼠中过度表达,而Wnt信号通常在癌症中发生突变;人类皮肤癌中发现了PPAN突变;爪蟾的核糖体病表型中PPAN缺失。为了探明PPAN在肿瘤的发生发展中发挥着怎样的作用,我们做了一系列实验来进行探究。使用多种能诱导DNA损伤的化疗药物以及DNA剂探究PPAN对药物的敏感性,探究药物引起PPAN表达增加的机制,寻找能够与PPAN发生相互作用且与DNA损伤修复或肿瘤的发生发展相关的蛋白质,敲低PPAN后查CHIR-99021价格看一些与DNA修复相关的蛋白质的变化。通过研究我们发现:PPAN对几种不同的化疗药物和DNA损伤剂存在着不同程度的敏感性;PPAN与RCC2存在相互作用,而RCC2是一个与肿瘤的发生发展密切相关的蛋白质;PPAN的敲低阻碍ATM蛋白的磷酸化并抑制MDMGene Expression2的表达。这些结论初步说明了PPAN和DNA损伤修复存在一定的相关性。

目的 探讨发热伴血小板减少综合征(SFTS)患者多药耐药菌感染特点及危险因素分析。方法 选取2018年3月至2023年3月于本院住院治疗的320例SFTS患者，分析其多药耐药菌(MDRO)感染情况，包括MDRO检出部位以及菌群分布情况。对MDRO感染的危险因素进行单因素和多因素Logistic回归分析。结果 658份样本中共培养出多药耐药菌68株，其中尿液标本检出率最高(14.49%);其luminescent biosensor次是痰液标本(10.10%), 68株MDRO中革兰阴性菌48株(70.59%),其中检selleck NN2211出率最高的是肺炎克雷伯菌(20.59%);革兰阳性菌20株(29.41%),其中检出率最高的为溶血葡萄球菌(14.71%)。分析显示，患者年龄和极期外周血CD4~+T细胞数是MDRO感染的独立影响因素。结论 SFTS患者多药耐药菌感染较为多见，临床上应重点关注其危险因素，加强对病原菌的监测和药敏试验分析，合理应用抗菌药GDC-0068物。

研究背景胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是中枢神经系统(Central nervous system,CNS)恶性程度最高的颅脑肿瘤,预后极差。目前,GBM标准的治疗措施为手术切除病灶辅以术后的放疗及替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)口服的同步化疗,患者的中位生存期仅为14个月左右。肿瘤电场治疗(Tumor-treating fields,TTFields)作为胶质母细胞瘤最新的治疗手段,一定程度上提高的患者的生存期,但是整体治疗效果仍不尽人意。其他的治疗手段,如免疫疗法、基因疗法、溶瘤病毒疗法等仍处于起步阶段。胶质母细胞瘤大多数为浸润性生长,通常会浸润到正常的脑组织内,使手术切除病灶变得非常困难。此外,抑制性的肿瘤免疫微环境、胶质母细胞瘤低氧微环境、胶质瘤干细胞(Glioma stem cells,GSCs)的存在、复杂的基因突变、血脑屏障的限制是制约GBM治疗的重要因素。随着纳米技术手段的不断进步,各种有机、无机、天然的纳米颗粒开始在脑肿瘤治疗中尝试,具有血脑屏障穿透性的配体或靶向肽修饰开始应用于血脑屏障的穿透,为胶质母细胞瘤的治疗带来了新的变革。外泌体(Exosomes)是一种直径在30-150nm左右的细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs),内含脂质、蛋白质和核酸等物质,参与细胞的起源及细胞间的信号传递。外泌体被认为是治疗许多疾病的载体,如骨骼再生、心肌保护、组织修复等。最新研究发现,外泌体具有良好的生物相容性及穿透血脑屏障的能力,这种天然的生物学优势使其可用于颅脑疾病的治疗。但近期的研究发现,静脉注射的外泌体主要分布在肝脏及肾脏,注射的外泌体仅有很少的一部分保留在大脑或肿瘤部位。因此,开发可特定靶向胶质母细胞瘤的方法是一个关键的技术难题。利用物理、化学或基因修饰的方法修饰外泌体,制造用于药物或基因递送的工程化外泌体(Engineering exosome),可使外泌体获得更强的血脑屏障穿透能力及靶向递送水平。随着纳米技术的不变进步,磁性纳米颗粒(Magnetic nanoparticles,MNPs)因其材料结构灵活、粒径小、超顺磁性、生物相容性等特点,在分析传感及生物医学领域应用广泛。其中,氧化铁纳米颗粒(Ironoxidenanoparticles,IONPs)在药物递送、磁共振成像和肿瘤治疗等领域都有对应的应用。因此,将磁性纳米材料的顺磁靶向性与工程化外泌体的主动靶向性结合,有望为胶质母细胞瘤的靶向治疗提供一个新的治疗模式,实现多重靶向的递送策略。铁死亡(Ferroptosis)是一种近期新发现的调控细胞死亡的新方式,它由过度脂质过氧化所诱导。铁死亡主要在二价铁或脂氧合酶的作用下,催化不饱和脂肪酸,诱导细胞膜发生脂质氧化;此外,谷胱甘肽含量下降也是铁死亡的重要原因。但在脑肿瘤治疗领域,因血脑屏障的限制,制约了铁死亡相关制剂在GBM中的应用;此外,最新研究发现,铁死亡中存在复杂的信号通路。因此,筛选出GBM中关键的铁死亡通路,并利用医工交叉的手段实现关键靶点药物的递送是我们本研究的重点。本研究中,我们设计了一种结合了工程化外泌体复合磁性纳米颗粒的复合治疗平台,通过靶向线粒体中两条协同铁死亡通路联合氧化铁纳米颗粒的二价铁离子释放实现了胶质母细胞瘤的铁死亡治疗。其中,磁性纳米颗粒由Fe3O4为内核,外壳为介孔SiO2,该壳核结构赋予了该体系磁靶向特性及药物封装能力;另一方面,工程化外泌体通过基因改造,拥有更强的血脑屏障穿透能selleck JQ1力及胶质瘤靶向特性,通过电穿孔还可实现siRNA-GPX4的封装达到基因治疗目的。该复合体系一方面突破了血脑屏障的限制,提出了磁靶向及脑内主动靶向的新策略;另一方面探究了该治疗体系铁死亡疗法的具体机制,为胶质瘤的靶向递送策略提供了新的思路及方式。第一部分工程化外泌体复合磁纳米颗粒的设计与合成及其胶质母细胞瘤靶向能力的研究目的设计并合成工程化外泌体复合磁性纳米颗粒,并通过体内外实验检测其穿透血脑屏障、靶向胶质母细胞瘤的能力。方法1、工程化外泌体的设计与合成使用慢病毒基因修饰方式对人脂肪来源间充质干细胞进行基因改造,通过超速离心法获取基因修饰后的工程化外泌体,并通过Western Blot、透射电镜、粒径分析等方式对不同的外泌体进行表征。2、工程化外泌体靶向能力验证对提取的工程化外泌体及普通外泌体进行体外胶质瘤细胞靶向能力验证,通过共聚焦免疫荧光图像、流式细胞术等方式检测基因修饰后的工程化外泌体的GBM细胞主动靶向能力。3、磁性纳米颗粒的设计与合成设计并合成以Fe3O4为内核,介孔SiO2为外壳的磁性纳米颗粒,并利用化学修饰法对其表面进行改性,实现CD63抗体的枝接;通过扫描电镜、透射电镜、红外衍射、X线衍射、核磁共振等实验对材料结构及功能进行表征。4、工程化外泌体复合磁性纳米材料的构建及多重靶向能力验证通过孵育法合成外泌体与磁性纳米材料复合的纳米载体,并用共聚焦免疫荧光图像、透射电镜等方式对该复合体系进行表征,并进一步检测其生物相容性;构建小鼠3D打印的磁性头盔及小鼠荷瘤模型,通过小鼠体外生物成像、小鼠器官生物成像、小鼠颅脑电感耦合等离子体质谱、冰冻切片等方式对材料的多重靶向能力进行验证。结果1、通过ANG-LAMP2B慢病毒基因修饰方式构建的工程化外泌体直径大小与正常外泌体接近且透射电镜提示其微观结构一致,Western Blot提示该外泌体具有丰富的EVs特异性蛋白指标,符合外泌体国际鉴定标准。2、免疫荧光及流式细胞术分析结果提示,ANG-LAMP2B基因修饰后的工程化外泌体具有更强的被GBM细胞吞噬的能力,其靶向能力与ANG靶向肽配体与GBM细胞中LRP1受体的相互结合密切相关。3、设计及合成的壳核结构Fe3O4@SiO2磁性纳米颗粒结构完整,介孔结构良好,磁靶向能力强,且具有良好的MRI成像能力。4、免疫荧光及透射电镜等表Cellular mechano-biology征结果提示混合孵育法获得的工程化外泌体复合纳米颗粒结构完整,体外生物相容性良好。小鼠体外生物成像、多脏器成像等结果提示复合工程化外泌体的磁性纳米材料可在小鼠脑内实现最强的脑肿瘤区域富集。结论1、ANG肽修饰的工程化外泌体具有更强的血脑屏障穿透能力及脑肿瘤靶向能力。2、ANG-LAMP2B修饰的工程化外泌体复合磁性纳米材料结构均匀,可制备为多功能的纳米治疗平台。3、工程化外泌体复合磁性纳米颗粒联合3D打印磁性头盔可在小鼠体内实现脑肿瘤区域富集,为GBM的主动靶向治疗提供崭新模式。第二部分复合纳米颗粒介导的铁死亡疗法的作用机制及其应用研究目的探究胶质母细胞瘤中铁死亡相关通路,并进一步证实工程化外泌体复合磁性纳米颗粒介导的铁死亡疗法在胶质母细胞瘤治疗中的具体效果并探究其具体机制,进一步检测该靶向体系的生物相容性及安全性。方法1、胶质母细胞瘤中铁死亡通路关键靶点的关系验证通过GEPIA数据库生物信息学分析,不同胶质瘤细胞系Western Blot表达量检测及通路干扰实验,探究在GBM中铁死亡关键通路蛋白GPX4与DHODH的具体关系。2、铁死亡通路小干扰RNA及小分子抑制剂的装载针对铁死亡通路中关键靶点GPX4及DHODH,分别使用外泌体电转染的方式将GPX4的小干扰RNA封装在外泌体内,并通过孵育的方式将DHODH的小分子抑制剂Brequinar(BQR)封装在磁性纳米颗粒介孔SiO2的孔隙内,并通过pH释放实验、免疫荧光共定位实验鉴定两者的装载。3、体内外实验验证该复合治疗体系的综合铁死亡治疗效果体外细胞验证:分别通过CCK8实验、Western Blot蛋白表达量检测、丙二醛(MDA)测定、谷胱甘肽(GSH)含量测定、FerroOrange二价铁离子测定、ROS活性氧测定等实验检测该治疗平台在体外导致GBM细胞铁死亡的效果;体内实验验证:构建裸鼠胶质瘤模型,通过体外肿瘤发光成像、裸鼠生存期分析、H&E染色、铁死亡Marker免疫组化检测等方式评价该治疗体系体内治疗疗效。4、复合治疗体系的生物安全性评测通过小鼠多脏器H&E染色切片检测、小鼠血液系统指标检测、小鼠颅脑MRI等检测方式对该复合治疗体系的生物安全性进行综合评估。结果1、GEPIA数据库生信分析及胶质瘤细胞Western Blot蛋白表达量提示,与正常组织或正常星形胶质细胞相比,GBM中GPX4及DHODH的表达量上调,且通过siRNA敲低GPX4后,DHODH的表达量代偿性的上升。同时靶向这两条铁死亡通路PLX-4720体内是促进GBM铁死亡的有效模式。2、免疫荧光共定位提示通过电转染成功将siGPX4封装在了外泌体内,Western Blot结果提示与Lipo3000转染试剂相比电转染效率约为16.6%;紫外分光光度法提示低pH(pH=5.5)下介孔硅内BQR释放率更高。3、体外细胞实验提示该复合治疗体系可以明显促进细胞的铁死亡;裸鼠体内动物实验也得到了同样的结果,应用该复合治疗体系后肿瘤缩小,小鼠生存期明显延长且免疫组化结果提示肿瘤细胞发生了铁死亡。4、小鼠颅脑MRI结果提示该复合治疗体系可用于MRI成像且肿瘤大小明显缩小;小鼠多脏器H&E染色及血象检测提示应用该治疗体系无明显肝肾毒性及血液学改变,提示该治疗模式良好的生物安全性。结论1、同时靶向GPX4及DHODH通路是诱导胶质母细胞瘤铁死亡的有效方式。2、外泌体电穿孔siRNA-GPX4结合介孔硅装载DHODH靶点小分子抑制剂的复合治疗体系可在体内外有效诱导GBM铁死亡,且生物安全性良好。3、该复合治疗体系可以通过药物的多样选择成为胶质母细胞瘤的综合治疗平台,为胶质瘤的靶向治疗提供新的思路。

目的:冷冻保存牙再植后常发生破porous biopolymers骨细胞(Osteoclast,OC)相关的根吸收,而粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)与OC诱导分化关系密切,本研究主要探究在冷冻条件下人牙周膜细胞(Human periodontal ligament cells,hPDLCs)中GM-CSF的合成和分泌;GM-CSF与hPDLCs的增殖、迁移、向OC分化的关系,阐述GM-CSF与冷冻保存hPDLCs的相互作用,为减少冷冻后牙再植发生根吸收提供研究基础和实验依据。方法:1.组织块酶消化法培养hPDLCs,免疫细胞化学(Immunocytochemistry,ICC)鉴定细胞来源。2.细胞分组:炎症因子IL-1β处理组、常温常规培养组、冻存组(慢速冷冻方式冻IDN-6556供应商存三个月),酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、实时荧光定量(Real time quantZD1839溶解度itative PCR,RT-qPCR)、蛋白免疫印迹(Western blot,WB)、ICC检测组间GM-CSF表达的差异。3.CCK-8、细胞划痕实验检测GM-CSF对hPDLCs增殖、迁移能力的影响。4.细胞分组:GM-CSF处理组、炎症因子IL-1β处理组、GM-CSF siRNA+IL-1β处理组,RT-qPCR比较组内、组间OC诱导分化相关因子的基因表达。结果:1.成功分离培养hPDLCs;抗波形丝蛋白阳性表达,抗角蛋白阴性表达,表明其中胚层来源,可为后续实验提供体外细胞来源。2.炎症因子IL-1β处理组、冷冻组的GM-CSF合成分泌量均比常温常规培养组高,其中冻存组与1 ng/m L IL-1β作用后的GM-CSF表达量相当。3.25 ng/m L GM-CSF作用下的hPDLCs殖速度明显加快,随GM-CSF浓度升高hPDLCs增殖速度愈快;高浓度GM-CSF更能促使hPDLCs迁移。4.随GM-CSF浓度升高,hPDLCs中OC诱导分化相关因子的表达逐渐上升,骨保护素(Osteoprotegerin,OPG)表达量在低浓度GM-CSF时降低,后随浓度升高其表达水平逐步上升;随IL-1β浓度的升高,hPDLCs中OC诱导分化相关因子的表达水平上升;敲低GM-CSF的表达后,炎症因子IL-1β不再上调OC诱导分化相关因子的表达,OPG上升水平不再显著。结论:冷冻后复苏的hPDLCs中GM-CSF的合成和分泌水平上升;GM-CSF促进hPDLCs的殖和迁移理论上有利于牙周膜的愈合,而基因水平发现,GM-CSF上调OC诱导分化相关因子的表达,充分显示了其对hPDLCs的复杂作用,为冷冻保存离体牙再植后的牙周膜愈合和牙根吸收的发生机制提供新的探索路径。