RAF信号通路

目的 探索急性高容量血液稀释联合术中自体血回输技术对老年全髋关节置换术患者血液保护功能和凝血功能的影响。方法 选取2021年6月至2023年3月金华市中心医院择期行全髋关节置换术患者100例，采用随机数字表法分为研究组和对照组，每组50例。两组均采用全麻，研究组在手术开始前0.5 h从颈内静脉快速输入15 mL/kg的乳酸钠林格注射液和羟乙基淀粉130/0.4电解质注射液（1∶1）进行急性高容量血液稀释，对照组常规速度输注乳酸钠林格注射液，两组患者术中均行自体血回输。分别于入手术室（T0）、手术结束（自体血回输已完成，T_1）、术后24 h(T_2)检测Hb及行血栓弹力图检测评估凝血功能，统计T_1、T_2Hb较T_0Hb下降值，记录术中出血量、术中术后是否有输注异体血，并于术后3、7及30 d随访患者，记录肺栓塞发生率。结果 两组患者术中出血量比较差异无统计学意义（P>0.05）。在T_1、T_2Hb较T_0Hb下降值方面，研究组较对照组均明显减少，差异均有统计学意义（均PSAG<0.05）。在异体血输注比例方面，研究组较对照组明显减少，差异有统计学意义（P<0.TORCH infection05）。两组患者在血栓弹力图检测的凝血功能方面及术后肺栓塞发生率比较差异均无统计学意义（均P>0.05）。结论 急性高容量血液稀释联合术中自体血回BYL719研究购买输技术对老年全髋关节置换术患者有血液保护作用，减少围术期异体输血，不影响凝血功能且不增加术后肺栓塞发生率，具有重要的临床意义。

背景:先天免疫细胞在抗肿瘤免疫监视和抗肿瘤适应性细胞免疫的发展中至关重要。大量的研究数据表明,先天免疫细胞可经过响应特定的初始刺激进行训练,接受刺激的先天免疫细胞会经历长期的转录组学和代谢水平的改变,以及表观遗传学的重编程,以调整其细胞功能。该过程被称为“训练固有免疫”,这些经过训练的细胞会显示出类似记忆的特征,可以对二次同源甚至异源刺激产生更快速和更强的确认细节反应,表现为免疫反应的增强,例如促炎细胞因子和ROS表达。目前逆转先天免疫细胞的促肿瘤表型的免疫疗法已经成为了一种有吸引力的抗肿瘤方法,由此衍生出来了一种以联合固有免疫与适应性免疫应答为特点的免疫疗法,而训练固有免疫概念的提出,为这种先天免疫与适应性免疫的协同免疫疗法提供了可能。同时训练免疫诱导的先天免疫系统激活也可以增强癌症疫苗的功效,由于目前的治疗性癌症疫苗主要是以刺激机体产针对肿瘤特异性抗原的适应性免疫应答为主,无法克服先天免疫细胞在肿瘤微环境的免疫抑制状态,而训练免疫概念的提出,为克服这一障碍提供了可能性。目前公认胞壁酰二肽(MDP)可以通过与细胞内的受体核苷酸结合寡聚结构域2(NOD2)的结合从而诱导训练固有免疫,β-葡聚糖(β-glucan)同样是一种训练固有免疫的诱导剂,β-glucan信号通过细胞外的dectin-1受体诱导激活训练免疫。以MDP、β-glucan训练免疫诱导作为抗癌策略,与纳米材料联合建立的诱导训练免疫的纳米生物免疫疗法,协同肿瘤特异性的适应性免疫来实现抗肿瘤的策略可能是新一代肿瘤疫苗的研发方向。目的:本课题研究目的是设计开发一种新型的肿瘤疫苗来实现固有免疫与适应性免疫协同的抗肿瘤作用。基于纳米递送系统,利用训练固有免疫的诱导剂联合特异性的肿瘤抗原开发一种可以诱导训练免疫的特异性肿瘤纳米疫苗,从而打破免疫抑制的肿瘤微环境,激发机体高效的先天免疫与适应性免疫应答来实验现抗肿瘤效应,同时评估在使用抗原特异的肿瘤疫苗促进抗肿瘤适应性免疫反应时诱导训练免疫是否有益。方法:首先利用乳液-溶剂蒸发法,制备基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物((poly(lactic-co-glycolicinnate antiviral immunity acid),PLGA))的纳米颗粒(E7-MDP-NPs),其中 PLGA 同时包裹从细胞内水平进行训练免疫的诱导剂MDP和特异性肿瘤抗原人乳头瘤病毒(HPV)E7肽形成E7-MDP-NPs。然后利用海藻酸钠水凝胶(ALG)包裹E7-MDP-NPs以及从细胞外水平来训练免疫的诱导剂β-葡聚糖(β-glucan)构成了双相释放系统的治疗性HPV纳米肿瘤疫苗E7-MDP-NPs+β-glucan@ALG。然后利用激光共聚焦,体内示踪,流式细胞技术等评估纳米疫苗促树突状细胞(DC)成熟和活化的能力,同时考察该疫苗的免疫特性及溶酶体逃逸能此网站力,并通过体外的实验及体内的动物模型实验等评估该疫苗的训练免疫特征及其抗肿瘤效应。结果:本课题基于PLGA纳米颗粒协同训练免疫诱导剂MDP、β-glucan及E7肽在ALG的包裹下构成了一种可以诱导训练免疫的治疗性HPV疫苗,该疫苗可以诱导训练先天免疫并引发强大的抗肿瘤适应性细胞免疫应答,明显逆转了肿瘤的生长,甚至完全消除了已形成的肿瘤,具体结果为:(1)纳米疫苗E7-MDP-NPs+β-glucan@ALG可以显著促进DC的抗原摄取和成熟,同时纳米形式的疫苗增加了抗原的溶酶体逃逸能力;(2)ALG以及PLGA纳米颗粒的使用,使得该疫苗对荷载的“训练免疫”诱导剂及肿瘤抗原具有持续的缓释作用;(3)该疫苗在注射部位以“储存库”的形式持续释放训练免疫诱导物β-glucan,以及E7-MDP-NPs,促进了抗原与诱导物的淋巴结递送以及荷载抗原的DCs的淋巴结回流聚集,有效促进淋巴结效应T细胞应答。(4)进一步的体外以及体内研究显示,E7-MDP-NPs+β-glucan@ALG可有效诱导固有免疫细胞产生“训练免疫”特征,分泌促炎性的细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α,并表现独特的免疫记忆特点,即对二次同源或异源刺激有更强的应答;此外,诱导“训练免疫”显著增强了随后纳米疫苗激发的抗原特异的获得性抗肿瘤细胞免疫。(5)在肿瘤模型的免疫干预研究中,E7-MDP-NPs+β-glucan@ALG纳米疫苗显著抑制了 TC-1肿瘤的生长,甚至可逆转并消除已建立的肿瘤。从效应机制上讲,β-glucan协同MDP与肿瘤抗原的纳米递送,成功诱导了体内“训练免疫”,并显著增强了系统及肿瘤局部的适应性抗肿瘤效应细胞CTL的应答,同时下调了免疫抑制的MDSCs水平。结论:本课题创新性提出以诱导“训练免疫”为导向设计疫苗佐剂,协同特异性免疫应答来获得有效的抗肿瘤免疫,研究开发了一种基于双相释放系统的抗肿瘤纳米疫苗,其特点是对训练免疫诱导剂和特定肿瘤抗原的持续缓释和细胞的靶向递送,结果表明纳米疫苗制剂能够诱导训练先天免疫并引发强大的抗肿瘤适应性细胞免疫应答,明显逆转了肿瘤生长,甚至完全消除了已形成的肿瘤。本课题研究提出诱导“训练免疫”可能为开发有效的肿瘤疫苗提供新思路。

目的 观察以超声引导下关节腔内注射高渗葡萄糖(HG)治疗高原地区膝关节骨性关节炎的价值。方法 纳入91例高原地区膝关节骨性关节炎患者共124个病变膝关节，根据治疗药物将膝关节分为20%HG组(n=67)、25%HG组(n=42)及玻璃酸钠组(n=15);比较治疗前、后临床及超声评分，评估疗效。结果 治疗后第12、48周，3prostate biopsy组视觉模拟评分法(VAS)评分均较治疗前降低(P均<0.05),20%HG组和25%HG组Lysholm评分均较治疗前升高(P均<0.05)。25%HG组治疗前与治疗后第12周Lysholm评分差值、治疗前与治疗后第48周VAS评分差值此网站均高于20%HG组(P均<0.05)。20%HG组治疗后第48周关节渗出评分较治疗前降低(P<0.05),治疗后第12及48周滑膜血流评分较STM2457治疗前降低(P均<0.05);25%HG组治疗后第48周关节渗出评分较治疗前降低(P<0.05),治疗后第12及48周滑膜增生和滑膜血流评分均较治疗前降低(P均<0.05);玻璃酸钠组治疗后第48周关节渗出评分较治疗前降低(P<0.05),治疗后第12及48周滑膜增生评分均较治疗前降低(P均<0.05)。结论 超声引导下关节腔内注射HG、尤其注射25%HG对于治疗高原地区膝关节骨性关节炎具有一定价值。

目的：常见的先天性肾上腺皮质增生症（CAH）多以低血钠高血钾为特征，但临床上也会遇到伴有低钾血症的CAH患儿，对这类患儿进行临床分析，总结护理体会，旨在提高临床医护的认识。方法：回顾性分析2015年8月—2019年5月深圳市儿童医院内分泌科收治的8例CAH伴有低钾血症患儿的临床资料。结果：8例CAH患儿的年龄1个月27 d～8岁6个月，男女各4例。CAH的诊断年龄15 d～3AZD6738溶解度岁5个月。诊断21-羟化酶（21-OHD）缺乏、失盐型4例，21-OHD缺乏、单纯男性化1例，11β-羟化酶（11β-OHD）缺乏2例，17-OHD缺乏1例。血钾2.5～3.5 mmol/L，其中，中度低钾3例，轻度低钾5例。病因分析：2例11β-OHD缺乏和1例17-OHD缺FUT-175半抑制浓度乏均与病因有关，2例病程中伴有胃肠炎，丢失过多引起低血钾，1例摄入减少，1例营养不PacBio Seque II sequencing良，胃纳差导致钾摄入减少，1例为氟氢可的松剂量偏大。经积极治疗，护理和宣教后，血钾均恢复正常，无再发低钾血症。结论：当发现CAH患儿发生低钾血症时，需要从CAH的类型、摄入减少、丢失增多、盐皮质激素剂量以及合并疾病等方面进行分析、治疗，积极采取护理措施和宣教。

目的 评估2023年6月在我国（不含香港、澳门特别行政区和台湾地区，下同）发生或者可能由境外输入的突发公共卫生事件风险。方法 根据国内外突发公共卫生事件报告及重点传染病监测等各种资料和部门通报信息，采用专家会商法，并通过视频会议形diABZI STING agonist溶解度式邀请省（自治区、直辖市）疾病预防控制中心专家参与评估。结果 预计2023年6月突发公共卫生事件报告数可能较5月增多，以新型冠状病毒感染、流行性感冒、水痘、其他感染性腹泻病和手足口病等传染病类事件为主。自上次风险评估（2023年5月8日）以来至2023年6月6日，我国本土新型冠状病毒感GSK2118436配制染疫情呈现先波动上升后下降趋势；XBB系列变异株为境内疫情主要优势流行株；疫情对医疗秩序和社会正常运行影响较小；预计6月蘑菇中毒事件继续增多；预计6月高温中暑病例继续增多；根据既往报告情况，预计6月手足口病疫情将呈上升趋势；预计6月全国treatment medical发热伴血小板减少综合征仍将处于高水平阶段。结论 对新型冠状病毒感染予以特别关注，对蘑菇中毒、高温中暑、手足口病、发热伴血小板减少综合征予以一般关注。

目的:观察慢性心力衰竭急获悉更多性失代偿期(ADHnuclear medicineF)患者治疗前后血清乙酰肝素酶(HPSE)水平变化，研究慢性心力衰竭患者疗效与血清HPSE水平变化的相关性。方法:选取住院的ADHF患者50名纳入心衰治疗组，同期住院的有基础心脏病但尚未达到心衰程度的30名患者作为试验对照组，以及同期体检的30名健康正常人纳入正常对照组。观察心衰治疗组治疗前后血清HPSE的变化及与N端脑钠肽前体(N terminal pro brain natriuretic peptide, NT-proBNP)的相关性。结果:心衰治疗后较治疗前血HPSE和NT-proBNP水平均明显降低(P<0.05);治疗前血清HPSE水平高于试验对照组及正常对照组；治疗后血清HPSE指标高于正常对照组(P<0.05),与试验对照组无显著差异(P>0.05)。Pearson相关分析提示治疗前后血HPSE和NT-proBNP水平呈正相关。结论:ADHF患者血清HPSE水平显著增高，纠正心衰后指标明显下降，且与血NT-proBNP水平呈正相关，血清HPSE水平可能与心衰严重此网站程度有相关性。

作为一种天然多糖,透明质酸(Hyaluronicacid,HA)的来源广泛,生物活性良好,无论是在医药还是生活方面都得到了极大的应用。目前卫建委已经批准透明质酸钠作为食品添加原料,但由于HA的分子量差异较大导致生物活性也存在差异。因此,阐明不同分子量的HA口服转运机制,将为更好地发挥其生物学活性提供理论指导。本实验室前期成功建立了 5天Caco-2细胞单层模型,在此基础上,采用异硫氰酸荧光素(Fluoresceine isothiocyanate,FITC)标记的方法合成 10kD、40～100kD 和 100～200kD 的 FITC-HA,来研究不同分子量HA的口服转运效果和机制的差异性,为HA 口服吸收的分子量选择提供实验依据。本课题取得的主要成果如下:1.不同分子量HA的荧光标记和结果验证本实验通过酪胺法和还原胺化法将10 kD、40～100 kD和100～200 kD的HA与FITC进行缀合,然后使用透析和AKTA Pure对粗产物进行分离纯化和初步检测,再利用琼脂糖凝胶电泳、多功能酶标仪、苯酚硫酸法验证了纯化产物的荧光吸收和糖含量,证明三种不同分子量的HA已经被成功标记,并得到10 kD、40～100 kD和100～200 kDFITC-HA的单位摩尔标记量平均值分别为25.19、11.24、6.22。2.5天Caco-2细胞单层模型的优化通过在7天Caco-2细胞单层模型基础上添加50μg/mL岩藻聚糖硫酸酯建立了 5天模型,并确认了该5天模型与7天模型在跨膜电阻值、碱性磷酸酶活性和渗透性标志物荧光黄、FITC、转铁蛋白和葡聚糖的转运效果上不存在差异。然后在5天模型上首次进行了体外大分子药物(上述合成的FITC-HA)和小分子药物阿霉素(Doxubicin,DOX)的转运实验,并与7天模型中的实验结果进行对比,针对HA转运结果的差异性,对5天模型提出使用方法优化,使10kD和100～200kDFITC-HA在该模型中的转运情况得到大幅改善,显示可以被良好吸收,表观渗透系数(Apparentpermeability coefficient,Papp)分别为3.02×106 cm/s和2.33×106 cm/s。还对比了葡聚糖、转铁蛋白以及小分子药物DOX在优化模型与7天模型中的转运结果,显示没有差异,这说明优化方法是符合Caco-2细胞单层模型使用标准的,也为其他药物的体外转运实验提供了更高效的模型选择。3.不同分子量HA在Caco-2细胞单层模型中的转运机制研究在优化模型中研究了 10kD和100～200kD两种属于不同分子量量级的HA在肠上皮细胞中的转运效果和机制,结果表明Caco-2细胞对10kD和100～200kDHA的摄取量会随着时间增多,且需要消耗能量,但随着时间延长会出现外排情况,转运量不会一直增加,这说明细胞上的转运载体数量有限会出现饱和,同时二者由于分子量差异导致转运效果也有明显不同,10 kD HA会比100～200 kD HA的转运效果更好,Papp值也Canagliflozin molecular weight更高。随着抑制剂氯丙嗪(Chlorpromazine,CPZ)和 Dynamin GTPase 抑制剂(Dynasore)的加入,10 kD 和 100～200 kD FITC-HA 的 Papp 值分降低了 84.61%和 28.15%、41.41%和60.06%,但是甲基-β-环糊精(Methyl-β-cyclodextrin,MβCD)对 10 kD 和 100～200 kD FITC-HA几乎没有影响,这说明10 kD和100～200 kD FITC-HA的转运可能受网格蛋白介导的内吞途径影响,但是受小窝(脂筏)蛋白的作用比较小。对于巨胞饮途径,在给药 TRPP3 channel 抑制剂(TRPP3 channel inhibitor,EIPA)后,10 kD 和 100～200 kD FITC-HA的转运抑制率分别为6.18%和89.25%,表现出明显差异;对于胞内转运过程,在加入莫能菌素(Monension)后,二者的转运抑制率分别为89.99%和60.47%,这表明10 kD和100～200 kD HA的转运可能都和内体酸化到溶酶体成熟的过程有关;对比加入诺考达唑(Nocodazole)后,100～200kDHA转运率下降了 82.26%,但对10 kDHA影响不大,这说明还有一部分100～200 kDHA是依赖微管蛋白在胞内进行迁移转运的。综上所述,本实验课题用FITC对10 kD、40～100 kD和100～200 kD的HA进行了荧光标记,在优化后的Caco-2细胞单层模型中研究了 10kD和100～200kD的FITC-HA的转运机制以及差异性,结果表明10 kD和100～200 kD HA的转运都是时间和能量依赖性的,但10 kDHA的转运效果明显Others抑制剂更高。在内吞途径中,10kD和100～200kD HA都表现出网格蛋白依赖性的胞吞转运机制,同时100～200 kD HA也依赖巨胞饮作用;在Caco-2medial entorhinal cortex细胞内的转运过程,10kD和100～200 kDHA都受内体酸化的影响,同时还有部分100～200 kD HA依赖于微管蛋白的介导转运。本课题全面阐述了不同分子量HA 口服吸收转运机制以及差异性。

为探明枸杞单株芽叶的适制茶类，本研究将2种枸杞单株芽叶分别用绿茶和白茶加工工艺，制成4种枸杞芽叶茶，并采用顶空固相微萃取-气相色谱-飞行时间质谱联用技术（HS-SPME-GC-TOF-MS）、生化成分分析和感官审评法，结合主成分分析(principal component analysis，PCA)、香气活度值(odor activity value，OAV)及多元统计分析4种枸杞芽叶茶的风味特征。结果表明，M单株加工的绿茶感官品质得分最高，其次是M和A单株分别加工的白茶，而A单株selleck SAG加工的绿茶Biological data analysis得分最低。M单株加工的绿茶总酚和类黄酮含量最高，A单株加工的绿茶水浸出物含量最高。4种茶中共检测出58种挥发性物质，其中香叶基丙酮、正己醇、二氢猕猴桃内酯、苯乙醇、苯甲醇、萘、α-松油醇为AB、MB呈现花香、清香的特征香气成分；1-辛烯-3-醇为AL呈现果香的特征香气成分；2，5-二甲基吡嗪、3，5-辛二烯-2-酮、β-环柠檬醛、苯甲醛、乙酸叶醇酯、乙酸己酯为ML呈现花果香、清香的特征香气成分。可见M单株适制绿茶、白茶，A单株适制白茶，A、M单株加工白茶呈花香、清香的风味特征，A单株加工绿茶呈果香的风味特征，M单株加工绿茶呈花果香、清香的风味特征。本研究明确了枸杞A、M单株适制茶类及枸杞芽叶茶GSK1120212的风味特征，为枸杞芽叶茶的利用提供参考。

单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes,Lm)是一种致死率较高的食源性病原菌,依赖于多种表面蛋白促进对宿主感染。Lm表面蛋白主要分为共价结合蛋白,非共价结合蛋白和膜锚定蛋白,它们通过特定的相互作用附着在细胞壁上。壁磷壁酸(Wall teichoic acids,WTAs)是细胞壁表面最丰富的糖聚合物,参与细菌表面蛋白的锚定,进而调节细菌形态、自溶和毒力。WTAs结构是细菌菌体抗原的基础。在李斯特菌中,WTAs分为两种类型,分别是以鼠李糖或N-乙酰葡萄糖胺修饰的Ⅰ型WTAs(血清型1/2、3和7)和以葡萄糖/半乳糖进一步修饰N-乙酰葡萄糖胺的Ⅱ型WTAs(血清型4、5和6)。目前已经揭示鼠李糖修饰的Ⅰ型WTAs通过GW(glycine-tryptophan)结构域促进InlB和Ami在细胞表面的有效保留,介导细菌的自溶活性和毒力。此外,半乳糖基化的Ⅱ型WTAs对毒力蛋白InlB的表面锚定同样至关重要。GW结构域广泛存在于革兰阳性细菌中参与表面蛋白的锚定,但其与糖基化修饰WTAs之间的具体结合机制有待深入研究。前期从暴发李斯特菌病病例的羊脑中分离获得Lm XYSN菌株,经基因组学比较分析,发现其与谱系Ⅱ的血清型1/2a菌株具有较近的遗传地位。为了揭示Lm XYSN高毒力的分子致病机制,构建了转座突变库,以人结肠癌上皮细胞为体外模型,对毒力相关基因进行了高通量筛选。LMxysn_1095::Tn对Caco-2BBe细胞系的侵袭力显著下降,对小鼠的毒力相比野生株降低了 105倍。进一步分析提示LMxysn_1095基因(galT)所在的基因簇有可能参与WTAs糖基化修饰,而该基因在细菌毒力中的分子作用机制还有待阐明。本研究以Lm XYSN为生物材料,研究了其菌体和鞭毛抗原以及毒力表型;解析了 Lm XYSN菌株的WTAs结构及galT在WTAs糖基化修饰过程和毒力中的作用;探究了独特的WTAs结构与毒力蛋白锚定的锚定机制并初步明确了 LygA蛋白的生物学功能;通过小鼠模型评价了ΔgalT缺失株作为减毒活疫苗的保护性免疫应答。本研究有助于揭示血清型4h菌株独特的WTAs结构在李斯特菌致病中的作用机制,同时为李斯特菌病的预防和治疗提供理论基础。1.新现血清型4h单核细胞增生李斯特菌的毒力评价玻板凝集试验结果显示Lm XYSN的菌体抗原是4型,鞭毛抗原与H-A和H-B凝集,不与H-C反应。因其不同于现有13种血清型的组合,该类菌株的血清型被命名为新的血清型4h。利用结肠癌上皮细胞系Caco-2BBe测定了血清型4h菌株(Lm XYSN、Lm 16E和Lm 15LG)与强毒参考菌株的细胞侵袭能力。结果显示血清型4h菌株的细胞侵袭能力均显著高于其它所有Lm菌株。同时,以相同剂量感染C57BL/6小鼠,血清型4h菌株在多个脏器中的定殖能力均显著高于其它参考菌株,并在3-5天内引起小鼠死亡。以1×109 CFU灌胃感染豚鼠结果显示,Lm XYSN感染组豚鼠全部死亡,而Lm EGD-e感染组均存活。这些结果表明血清型4h菌株具有较高的毒力。对易感宿主湖羊灌胃感染Lm XYSN和Lm EGD-e,监测6d内湖羊的体温体重变化。结果显示Lm XYSN感染组湖羊与空白组的相比体温上升,体重下降,而Lm EGD-e感染组相对稳定。同时,Lm XYSN在肝脏和肠道中的定殖能力比Lm EGD-e高158-426倍。Lm XYSN先后突破肠道屏障和血脑屏障引起胃肠炎和脑膜炎等典型的羊李斯特菌病,导致湖羊在感染21-39天内全部死亡。在感染早E7080 molecular weight期,Lm XYSN抑制湖羊脾脏、肝脏和肠系膜淋巴结中IFN-γ、TNF-α和IL-6的表达。此外,通过ELISA测定感染不同时间点外周血中IFN-γ的含量,结果显示相较于Lm EGD-e感染组,在感染第1 d和第2 d,Lm XYSN显著抑制了湖羊体内IFN-γ的分泌。这些结果表明血清型4h菌株在感染早期显著抑制体内促炎因子的表达,从而促进细菌在体内的生存与致病。2.半乳糖基转移酶基因galT增强李斯特菌毒力的作用机制LMxysn_1095基因(galT)被预测为功能未知的糖基转移酶,其所在的基因簇有可能参与WTAs糖基化修饰。为此,通过电喷雾质谱解析了野生株和ΔgalT缺失株的WTAs结构,结果显示Lm XYSN的WTAs上仅有半乳糖基修饰,属于Ⅱ型WTAs(Gal-WTAs)。而galT基因的缺失导致WTAs上的半乳糖基缺陷,提示该基因编码半乳糖基转移酶(Galactosyltransferase,GalT),参与WTAs上的半乳糖基修饰。玻板凝集试验显示ΔgalT缺失株不能与菌体抗原的Ⅳ型Lm鉴定血清凝集,表明半乳糖基化WTAs是细菌菌体抗原的基础。透射电镜结果显示,ΔgalT缺失株的细胞壁结构改变。在对抗菌肽LL-37和CRAMP的耐受试验中,ΔgalT缺失株的生存能力显著降低。这些结果表明半乳糖基化WTAs通过维持细胞壁结构的完整性增加细菌对抗菌肽的抵抗力。提取细菌的细胞壁蛋白和分泌蛋白,通过WB分析毒力蛋白在细胞表面的定位。结果显示InlB、Ami和ActA蛋白从ΔgalT缺失株细胞表面脱落。同时,利用ActA抗体标记感染细胞的细菌,结果显示ΔgalT缺失株不能聚集宿主肌动蛋白,限制了其在细胞间的扩散,而野生株和回复株的细菌末端均能形成明显的哈雷彗星样尾巴。这些结果表明半乳糖基化WTAs通过促进毒力蛋白InlB、Ami和ActA的有效锚定,介导细菌毒力。以Caco-2BBe为细胞感染模型的试验结果显示,galT基因的缺失不影响细菌的黏附能力,但显著降低了细菌的侵袭和胞内增殖能力。细菌在小鼠脏器中的定殖能力测定结果显示,ΔgalT缺失株仅低剂量定殖于部分回肠中(72.44 CFU/g),而野生株和回复株在脏器中的细菌载量均处于较高水平(103-105 CFU/g)。此外,LD50测定结果显示ΔgalT缺失株的LD50相比于Lm XYSN增加了 105倍。这些结果充分表明galT基因是重要的毒力相关因子,促进细菌突破肠道屏障并定殖于肝脏和脾脏中。3.半乳糖基化壁磷壁酸与自溶素LygA互作介导细菌稳态和毒力提取Lm XYSN和ΔgalT菌株的细胞壁蛋白,利用定量蛋白组学分析进一步挖掘受半乳糖基化WTAs调控的表面蛋白,结果显示除InlB和Ami外,ΔgalT缺失株细胞表面一种新的GW结构域蛋白LMxysn_1092(LygA)蛋白含量降低了 24.42倍。qRT-PCR试验显示野生株和ΔgalT缺失株中lygA的转录水平相似,且WB结果证明大量LygA从ΔgalT缺失株细胞表面脱落。这些结果表明半乳糖基化WTAs对于LygA在细胞表面的有效锚定至关重要。为了探究LygA与WTAs之间的相互作用,将纯化的LygA蛋白偶联在CM5芯片表面,分别用Lm XYSN、ΔgalT和ΔgdlT::galT菌株的WTAs作为分析物,通过表面等离子共振技术(SPR)测定两者之间的结合能力,结果显示LygA与Gal-WTAs的亲和力(KD=1.54μM)显著高于其与半乳糖基化缺陷型WTAs的亲和力(KD=7.61μM)。同时,LygAGW蛋白与WTAs的SPR试验结果显示,其与Gal-WTAs的相互作用显示出与LygA相同的趋势,且在WTAs浓度相同的条件下,LygAGW与WTAs的结合能力更强。此外,通过WB分析GW基序数量对于LygA锚定的影响,结果显示随着GW结构域数量的持续减少,LygA逐渐从细胞壁表面脱落,尤其是当4个GW结构域被敲除时,LygA几乎失去了锚定能力。总之,这些结果表明LygA在细胞表面的完整保留通过C末端固定数量的GW基序与WTAs以Gal依赖的方式结合。此外,不受WTAs鼠李糖基化影响的Auto蛋白与Gal-WTAs具有较强的相互作用(KD=0.08 μM)。经氨基酸比对分析发现,Auto蛋白中的GW结构域与LyPF-03084014价格gA蛋白中的GW结构域同源性相对较低。这些结果表明WTAs与GW蛋白的结合能力取决于GW基序特定的氨基酸序列和WTAs糖基化模式的多样性。为了进一步探究LygA蛋白的功能,通过SMART软件分析显示LygA是由LYZ2和GW结构域组成的自溶素。利用溶壁微球菌测试了 LygA蛋白的水解酶活性,结果显示LygA的酶活为211 U,其可能改变了溶壁微球菌表面的疏水性,致使细胞大量聚集。受WTAs糖基化调控表面结合的自溶素Ami促进细菌的自溶。为了测试LygA在细菌自溶中的作用,成功构建了 ΔlygA、Δami和ΔlygA/ami缺失株。自溶活性测定结果显示在34h之内,ΔlygA缺失株的自溶生理水平略高于ΔlygA/ami双缺失株,但显著低于Δami缺失株。此外,蛋白组学分析显示LygA在细胞表面的含量显著高于Ami在细胞表面的含量。这些结果表明半乳糖基化WTAs借助于细胞壁表面的自溶素LygA和Ami促进细菌的自溶,其中LygA占主导作用。为检测LygA在细菌毒力中的作用,以Caco-2和HepG-2细胞评估了其对上皮细胞的黏附和侵袭能力,结果显示野生株和回复株相比于ΔlygA缺失株具有更高的黏附和侵袭能力。在小鼠灌胃感染模型中,LygA的缺失显著降低了细菌在肝脏、结肠和大脑中的定殖能力。这些结果表明LygA是Lm毒力所必需的,参与细菌在肠道的早期定殖和对宿主的进一步感染。4.ΔgalT减毒活疫苗候选株的保护性应答研究以C57BL/6小鼠为模型,皮下接种Lm XYSN和ΔgalT缺失株,评价候选疫苗的安全性,结果显示ΔgalT缺失株在肝脏和脾脏中的细菌载量均显著低于Lm XYSN感染组,并能在短时间内被机体快速清除。此外,免疫后小鼠各脏器的组织病理学分析显示,ΔgalT缺失株免疫组与PBS免疫组一样,各脏器均无病理学变化。这些结果表明ΔgalT缺失株作为减毒活疫苗具有较高的安全性。利用ELISA检测疫苗候选株免疫后小鼠体内抗体的变化规律,结果显示ΔgalT缺失株在免疫14 d后,诱导了抗Lm XYSN抗体,且抗体滴度逐渐增加,在免疫后21 d达到峰值。同时,在免疫后21 d对小鼠脾脏中细胞因子的转录水平进行测定,结果显示ΔgalT缺失株诱导Th1倾向的细胞因子IFN-y、TNF-α、IL-6和IL-17的高水平表达。重要的是,以致死剂量的Lm XYSN对免疫28 d后小鼠进行攻毒,结果显示ΔgalT缺失株能为小鼠提供100%免疫保护,且在免疫后105 d仍可提供83.3%的保护效率。这些结果表明ΔgalT缺失株可作为减毒活疫苗候选株,刺激机体产生强烈的体液免疫和细胞免疫应答,从而介导高水平免疫保护。综上所述,Lm XYSN为新现强毒株,对多种动物具有高致病力,基于其特有的菌体抗原和鞭毛抗原特征被新命名为血清型4h菌株。Lm XYSN的WTAs上仅有半乳糖基修饰,为Ⅱ型WTAs。galT基因参与WTAs上的半乳糖基修饰,并介导重要毒力蛋白InlB、Ami和ActA的表面锚定。同时,新发现的LygA自溶素通过一定数量的GW结构域与Gal-WTAs直接相互作用,调节细菌稳态和毒力。此外,ΔgalT缺失株作为减毒活疫苗候选株可高效保护同源型菌株的攻击。本研究揭示了独特的Ⅱ型WTAs在血清型4h菌株毒力增强中的作用机制,其可作为潜在的药物靶标,history of oncology对李斯特菌病的预防和控制具有重要意义。

2020年8月在福建海域用底拖网捕获雌莱氏拟https://www.selleck.cn/products/stm2457.html乌贼Sepioteuthis lessoniana 7尾，未性成熟个体2尾，平均体质量（210±43）g，已性成熟个体5尾，平均体质量为（430±76）gMedicina perioperatoria，用组织切片技术观察其卵巢的显微组织学结构，根据卵子的发生特征和变化规律划分卵子发生时期。结果显示：莱氏拟乌贼卵巢内的卵原细胞个体逐渐增大，细胞核由中央偏向一端直至消失；扁平状滤泡细胞和椭圆形滤泡细胞先后包裹卵母细胞，双层滤泡细胞在卵母细胞内增多并形成指状突起；卵黄物质在滤泡细胞解体时形成，最终充满卵母细胞。根据以上特征，将莱氏拟乌贼的卵子发生划分为4个阶段9个时期，即SB203580采购第一阶段卵原细胞期，第二阶段无滤泡细胞期、单层滤泡细胞期和双层滤泡细胞期，第三阶段滤泡细胞增生初期、滤泡细胞增生中期和滤泡细胞增生末期，第四阶段卵黄堆积期及成熟期。本研究认为莱氏拟乌贼卵子内的滤泡细胞起到合成并分泌营养物质的功能。