目的:本课题将围绕MAPK/ERK信号通路及胆固醇生物合成途径,阐明洛伐他汀(Lovastatin)的抗白血病作用机制,为Lovastatin用于白血病的治疗提供科学理论依据。方法:(1)通过流式细胞仪检测Lovastatin对HEL细胞周期和凋亡的影响。(2)采用Western-Blotting实验检测Lovastatin对Fli-1表达的影响。(3)采用Q-Real time-PCR分析Lovastatin对HEL细胞FAM83A、DDIT4表达的影响。(4)通过Wester n-Blotting实验检测Lovastatin对FAM83A、DDIT4、ERK、磷酸化ERK表达的影响。(5)利用慢病毒构建沉默KLF2及DDIT4的稳定HEL细胞株。(6)通过MTT法,检测sh KLF2、sh DDIT4对HEL细胞增殖的影响。(7)通过Western-Blotting实验检测sh DDIT4对ERK、磷酸化ERK表达的影响。(8)采用Q-Real time-PCR分析Lovastatin对HEL细胞KLF2表达的影响。(9)通过Western-Blotting实验检测Lov astatin对HEL细胞KLF2及白血病小鼠脾脏KLF2蛋白表达的影响。(10)采用Q-R eal time-PCR检测sh KLF2对FAM83A、DDIT4表达的影响,并通过Western-Blotti ng实验检测sh KLF2对FAM83A、DDIT4、ERK、磷酸化ERK表达的影响。(11)采用Q-Real time-PCR检测Lovastatin对胆固醇合成通路的18个基因以及相关基因SREBP1、SREBP2、APOA1表达的影响,并通过Western-Blotting实验检测胆固醇合成通路18个基因中的HMGCR、LSS、DHCR7蛋白表达。(12)采用Q-Re al time-PCR检测sh KLF2对胆固醇合成通路18个基因中的12个基因以及SREBP1、SREBP2表达的影响,并通过Western-Blotting实验进一步检测胆固醇通路HMGC R、LSS蛋白的表达。(13)采用F-Mu LV病毒构建白血病小鼠模型,检测Lovast atin对白血病小鼠存活时间的影响。结果:(1)流式细胞仪结果表明Lovastatin具有诱导HEL细胞凋亡的作用,并且Lo vastatin将HEL细胞阻滞在G1期(P<0.05)。(2)Fli-1在HEL细胞中属于经典的促癌基因,但Western-Blotting结果显示Lovastatin对Fli-1的表达无影响。(3)QReal time-PCR结果显示Lovastatin抑制FAM83A、DDIT4的表达。(4)WesternBlotting结果显示Lovastatin抑制FAM83A、DDIT4和磷酸化ERK的蛋白水平。(5)利用慢病毒沉默HEL细胞的KLF2后,通过MTT实验绘制细胞生长曲线结果显示,沉默KLF2后,与对照组Scrambled相比,sh KLF2促进细胞增殖。用Lovastatin处理后(sh KLF2+Lovastatin),与Scrambled+Lovastatin相比,抑制增殖作用减弱。沉默DDIT4后,与对照组Scrambled相比,sh DDIT4抑制细胞增殖。用Lovastatin处理后(sh DDIT4+Lovastatin),与Scrambled+Lovastatin相比,抑制增殖作用增强。(6)Western-Blotting结果显示sh DDIT4使磷酸化ERK的表达下调。(7)Q-Real time-PCR结果显示Lovastatin显著诱导KLF2表达。(8)Western-Blotting结果显示Lovastatin促进HEL细胞KLF2及白血病小鼠脾脏中KLF2蛋白的表达。(9)We stern-Blotting结果显示,沉默HEL细胞的KLF2,与Scrambled相比,DDIT4、FAM83A及磷酸化ERK蛋白水平升高。结合Q-Real time-PCR的结果,显示用Lovastat in处理后(sh KLF2+Lovastatin),与Scrambled+severe combined immunodeficiencyLovastatin相比,DDIT4与FAM83A的m RNA和蛋白水平均升高,磷酸化ERK表达也上调。(10)Q-Real time-PC R结果显示Lovastatin促进胆固醇合成通路18个基因中的16个基因的表达(对FDF T1、IDI1的表达无影响);同时,Lovastatin也诱导SREBP2、APOA1的表达,但是对SREBP1的表达无影响。此外,Western-Blotting结果显示Lovastatin促进胆固醇通路中HMGCR、LSS、DHCR7的蛋白表达。(11)Q-Real time-PCR结果显示s h KLF2促进SQLE的表达,降低MSMO1、MVD、HMGCR、MVK、TM7SF2和H MGCS1的表达,对CYP51A1、LSS、EBP、DHCR24、DHCR7、SREBP1、SRE BP2的表达无影响。同时Western-Blotting结果显示sh KLF2降低HMGCR的蛋白水平,不影响LSS的蛋白水平。(12)白血病小鼠实验结果显示与对照组相比,Lo vastatin明显延长白血病小鼠的存活时间,有统计学意义(P<0.05)。结论:(1)Lovastatin通过周期阻滞及诱导凋亡发挥抗白血病作用。(2)Lovastat in通过KLF2介导的DDIT4/MAPK/EselleckchemRK信号通路而阻止白血病细胞增殖。(3)L ovastatin通过KLF2调控的胆固醇合成获悉更多通路中的部分基因发挥抗白血病作用。