蓝靛果(Lonicera Caerulea L.),又称蓝靛果忍冬、蓝果(忍冬),俗称山茄子、羊奶子、黑瞎子果等,为忍冬科忍冬属灌木类浆果植物。蓝靛果果实富含花青素和Software for Bioimaging其他营养成分,且风味独特,被誉为“第三代水果”;蓝靛果花青素为黄酮类多酚化合物,在抗衰老、抗氧化等方面具有显著的效果。因此,开发利用蓝靛果种质资源具有广阔的市场前景。本试验在分析不同蓝靛果品种的花青素组分与含量基础上,结合综合性状表现,筛选出适用于花青素合成代谢中关键酶结构基因研究的种质材料,通过对结构基因克隆与分析进一步了解其遗传信息,为创制新种质与培育高含量花青素蓝靛果新品种提供理论依据。通过对10个不同品种(XL1、ZL1、ML3、X-8、X-10、2-1、3-1、6-1、06-2、06-4)及其不同时期蓝靛果果实花青素定性与定量分析表明,不同品种、不同时期花青素含量与组分显著不同。在果实完全转色期最多检测出9种花青苷组分,分别为矢车菊素-3,5-双葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-芸香糖苷、芍药素-3,5-双葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷和芍药素-3-O-芸香糖苷。每100 g蓝靛果果实中花青苷含量为262 mg-821 mg。在9种花青苷中,矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量占总花青苷含量的80%-87%,远远高于其它8种花青苷,说明蓝靛果果实中的花青苷主要以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为主,可以作为提取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的植物材料。蓝靛果幼果期(S1)、绿熟期(S2)、开始转色期(S3)、半转色期(S4)和完全转色期(S5)果实花青苷测定结果表明,S1、S2中未检测到花青苷,S3、S4和S5中花青苷种类分别为4种、6种、8种,每100g蓝靛果鲜果中花青苷含量分别为11.17±0.67 mg、100.45±2.11 mg、300.89±4.86 mg。说明果实越成熟,颜色越深,花青苷种类越多,含量越高。同时,采用第二代测序技术,基于Illumina测序平台对不同成熟期(S2、S4和S5)蓝靛果果实进行转录组测序,分析差异表达基因,筛选出蓝靛果花青素合成关键酶结构基因。对蓝靛果S2、S4KD025使用方法、S5果实进行转录组测序得到150 109个转录本,58 362个Unigene,其中,有6 005(10.29%)个Unigene与己知的6大公共数据库(NR、GO、KEGG、Pfam、egg NOG、Swissprot)均有匹配。对差异表达基因进行分析,共筛选出花青素合成关键酶结构基因19条,分别为:PAL 6条、C4H 2条、CHS3条、CHI 1条、F3H 1条、F3′H 1条、DFR 1条、ANS 1条、UFGT 3条。成功克隆了LcDFR基因,并构建pPICZαB-LcDFR表达载体。LcDFR基因全长为1 191 bp,编码396个氨基酸。对该蛋白进行生物信息学分析:LcDFR蛋白的分子式为C_(1981)H_(3092)N_(518)O_(590)S_(18)、相对分子质量为44.18 k D,理论等电点为5.70,含有一个保守结构域PLN02650,不稳定指数为33.66、平均疏水性为-0.243,属于稳定亲水性蛋白质,LcDFR蛋白无信号肽,但含有1个跨膜区,为非分泌型跨膜蛋白,该蛋白在细胞质、细胞核和内质网中的概率极大。蛋白结构分析发现,LcDFR蛋白主要由无规则卷曲组成。系统进化分析表明,LcDFR与大丽花、百日菊、黄花蒿、矢车菊、雪莲花亲缘关系较近,与小粒咖啡、茶树、红花油茶、欧selleck合成洲越桔、北高丛越桔亲缘关系较远。将pPICZαB-LcDFR表达载体进行线性化后转入毕赤酵母,通过zeocin抗性平板进行菌株筛选,挑取单菌落进行菌落PCR鉴定,对阳性菌株进行培养,成功获得转基因毕赤酵母。