蛋白激酶CK2(Casein Kinase 2)作为真核生物中广泛存在并高度保守的激酶家族,参与植物的光信号转导、生物钟调控、生物与非生物胁迫、种子贮藏和维持植物正常生长等多个生理过程。本实验室前期通过酵母双杂交实验(Yeast Two-Hyselleck NMRbrid,Y2H)证明了丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)CK2家族SmCKA2、SmCKB1和SmCKB2与SmMYB36发生互作,而且SmMYB36能促进丹参毛状根中丹参酮的积累。但它们的互作关系仍待进一步明确,同时也缺乏关于CK2家族在调节丹参次生代谢合成和逆境胁迫响应方面的相关研究报道。因此,本研究通过萤火虫荧光素酶片段互补图像技术(Firefly Luciferase Fragment Complementary Image Technology,LCI)进一步阐明丹参SmCK2与SmMYB36在烟草体内的互作情况;以丹参毛状根为材料,对丹参SmCKA2基因在调控丹参中次生代谢生物合成的功能进行分析;通过生理生化分析及分子生物学实验手段探究SmCKA2和SmMYB36在转基因材料生长发育过程和非生物胁迫过程中的作用。取得主要研究结果如下:1、采用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)ATCC15834介导的叶盘法获得了过表达SmCKA2转基因丹参毛状根,利用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)测定转基因丹参毛状根次生代谢物含量,发现过表达SmCKA2促进了丹参酮(二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮ⅡA)的积累;采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR)检测丹参酮合成途径中关键酶基因的表达量,结果显示过表达SmCKA2株系中羟甲基戊二酰辅酶A合酶1(Hydroxymethyl GlutaryCadmium phytoremediationl Co A Synthase 1,SmHMGS1)、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶2(Hydroxymethyl Glutaryl Co A Reductase 2,SmHMGR2)、香叶基香叶基二磷酸合酶1(Geranylgeranyl diphosphate Synthase 1,SmGGPPS1)和贝壳杉烯合酶1(Kaurene Synthase-Likes 1,SmKSL1)基因表达量显著上调。表明了SmCKA2能促进丹参酮生物合成途径中关键酶的表达进而提高丹参酮的积累。2、在前期Y2H实验结果基础上,利用LCI体系在烟草中进行体内实验,证实了SmCKA2、SmCKB1和SmCKB2和SmMYB36之间确实存在互作关系。把SmMY寻找更多B36截断为SmMYB36~(1-111)(包含R2R3结构域的N端)和SmMYB36~(112-160)(C端),结合Y2H和LCI实验证明SmCKA2分别与SmMYB36~(1-111)和SmMYB36~(112-160)存在互作关系。进一步明确了SmCKA2和SmMYB36的相互作用。3、用氯化钠(Sodium Chloride,NaCl)、聚乙二醇6000(Polyethylene Glycol 6000,PEG 6000)和脱落酸(Abscisic Acid,ABA)处理丹参野生型毛状根,检测SmMYB36和SmCKA2的基因表达量。结果表明,SmMYB36显示出对NaCl的快速响应,在处理0.5～48 h期间其表达量与对照相比显著提高(P<0.01);SmCKA2的表达量在PEG 6000处理6 h后与对照相比极显著提高(P<0.01),并且在48 h内一直维持在较高水平。该结果表明,SmMYB36可能参与对盐胁迫的响应,而SmCKA2可能参与对干旱胁迫的响应。4、用NaCl、D-甘露醇(D-Mannitol,DM)和ABA处理SmCKA2转基因和野生型(Wild Type,WT)拟南芥(Arabidopsis thaliana L.),探讨SmCKA2对非生物胁迫下种子萌发的影响。发现NaCl处理下,WT和转基因拟南芥种子萌发情况一致;DM处理后,SmCKA2转基因拟南芥种子萌发率显著低于WT;低浓度ABA处理下WT和转基因拟南芥种子萌发无显著差别,高浓度ABA处理后SmCKA2转基因拟南芥种子萌发受到抑制。表明SmCKA2过表达抑制了干旱胁迫下拟南芥种子萌发,并可能是由ABA信号转导通路介导的。5、用不同浓度的NaCl处理转基因大肠杆菌(Escherichia coli)ER2566、拟南芥和丹参毛状根,发现盐胁迫处理后,转化pGEX6P-1-SmMYB36重组载体的大肠杆菌比单独转化pGEX6P-1空载的大肠杆菌有更好的生长状态和更高生长速率。用NaCl处理WT和SmMYB36过表达转基因拟南芥,结果显示:SmMYB36转基因拟南芥与WT相比,种子萌发率大、根系伸长生长受抑制作用小、植株苗期生长状态较正常。生理指标测定结果显示:NaCl胁迫下SmMYB36转基因拟南芥的过氧化物酶(Peroxidase,POD)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase From Micrococcus Lysodeiktic,CAT)酶活性更高,叶绿素和脯氨酸的含量升高,同时丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、过氧化物和超氧化物的积累量下降,以此提高拟南芥对盐胁迫的耐受。转基因丹参毛状根也显示相同的结果,SmMYB36转基因毛状根的抗氧化酶活性比野生型高,而且MDA含量低于野生型。系统的表明了过表达SmMYB36能提高转基因材料对盐胁迫的耐受性。本研究进一步验证了SmCKA2、SmCKB1、SmCKB2和SmMYB36的相互作用关系,证明了SmCKA2参与丹参中丹参酮物质的合成,并且发现了SmCKA2和SmMYB36分别参与对干旱和盐胁迫的响应。