目的:网络药理学预测二仙汤(er-xian decoction,EXD)防治骨质疏松(osteoporosis,OP)的作用机制,实验探究EXD含药血清通过BK通道(BK channel)对成骨细胞或H_2O_2刺激的成骨细胞骨形成以及下游PTEN/AKT/FOXO1通路的影响。研究EXD含药血清干预的破骨细胞源囊泡对成骨细胞骨形成的作用。方法:1.通过TCMSP、Gene Cards数据库以及Venn图获取EXD活性成分、OP疾病靶点以及交集靶点,利用Cytoscape3.9.1软件构建”中药-活性成分-靶点”网络。在STRING官网生成蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络,并进行Gselleck NMRO和KEGG通路富集分析。2.在EXD含药血清和3 mmol·L~(-1)的氯化四乙胺(tetraethylamine chloride,TEA)处理下,采用CCK-8法检测MC3T3-E1细胞增殖活性的影响,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)试剂盒分别测定ALP活性与ALP染色。Western blot检测蛋白表达(BMP2、OPG和COL1),Real-time PCR检测m RNA表达(Runx2、OPG和BMP2),茜素红染色成骨细胞矿化区。此外,Western blot检测BK通道BKα与下游PTEN/AKT/FOXO1通路蛋白表达。3.构建H_2O_2刺激的MC3T3-E1细胞氧化损伤模型,使用TEA阻断成骨细胞BK通道,并检测EXD对H_2O_2刺激的成骨细胞骨向分化的影响。4.采用TRAP染色和薄骨片骨吸收实验观察EXD对破骨细胞增殖和分化影响。超滤法提取破骨细胞分泌的EVs,通过透射电镜、纳米粒度仪以及Western Blot法观察EVs的形态、粒径和标志物CD9、CD63、CD81。同时探究EXD含药血清干预的破骨细胞源EVs对成骨细胞骨形成影响。结果:1.确定EXD的32个活性成分、184个成分靶点和1Lung bioaccessibility252个OP相关靶点,筛选出70个交集靶点;网络拓扑分析发现EXD关键活性成分包含槲皮素,木犀草素,芹菜素和芦丁等;PPI网络筛MK-4827核磁选得到白细胞介素-6、肿瘤坏死因子、蛋白激酶B1、血管内皮生长因子A等为EXD治疗OP的关键靶点;GO功能分析发现主要与蛋白酶活性、调控细胞的炎症反应、氧化损伤、衰老增殖凋亡和血管生成等有关;KEGG通路分析显示主要与癌症通路、HIF-1、VEGF、FOXO和活性氧等信号通路有关。2.EXD含药血清可通过降低BKα蛋白表达来提高MC3T3-E1细胞的细胞活力。EXD含药血清可提高成骨细胞细胞ALP活性和钙结节形成,促进BKα、COL1、BMP2、OPG蛋白表达,促进RUNX2、OPG、BMP2 m RNA表达。此外,EXD含药血清可上调成骨细胞中AKT和FOXO1的磷酸化水平,降低PTEN的表达,但TEA可逆转EXD的这些作用。3.在H_2O_2的刺激下成骨细胞增殖和ALP活力降低,BKα、COL1、BMP2和OPG与磷酸化AKT表达下降,RUNX2、BMP2和OPG m RNA表达降低,钙结节面积显著缩小。EXD含药血清干预可以提高H_2O_2刺激的成骨细胞增殖和ALP活力,上调BKα、COL1、BMP2、OPG和磷酸化的AKT、FOXO1蛋白表达,促进RUNX2、BMP2和OPG m RNA表达,增大钙结节面积,但TEA可逆转EXD的这些作用。4.EXD含药血清可以抑制破骨细胞的增殖、TRAP活性和薄骨片骨吸收能力。破骨细胞源EVs呈椭圆形,粒径大小约45nm,标志蛋白CD9、CD63和CD81表达明显。EXD含药血清可以改善破骨细胞源EVs对成骨细胞增殖、ALP、OPG、COL1和钙结节生成的抑制作用。结论:1.EXD可能通过槲皮素,木犀草素,芹菜素,芦丁和朝霍定A等活性成分,作用于AKT、FOXO、VGEF和活性氧等信号通路,从而发挥抗OP作用。2.EXD含药血清通过促进BK通道蛋白表达并激活下游PTEN/AKT/FOXO1信号通路促进成骨细胞骨形成,而TEA可削弱EXD的这些作用。3.EXD含药血清通过提高BK通道蛋白表达,并影响下游AKT/FOXO1信号通路,从而抵抗H_2O_2刺激的成骨细胞氧化损伤,而TEA可削弱EXD的这些作用。4.EXD含药血清可抑制破骨细胞的增殖、分化和骨吸收,并通过破骨细胞囊泡促进成骨细胞骨形成作用。