背景众所周知,适量的规律性运动有益于健康维护和促进,但剧烈运动或力竭运动(Exhaustive exercise,EE)可通过氧化应激途径引起包括肌肉、肝脏等在内的、以炎症表现为主的多器官组织损伤,且目前对此尚无有效防治措施。近年来研究发现,区域免疫调控在肝脏炎症进程中起着重要作用。肝脏巨噬细胞是肝脏区域免疫调控的重要参与者,在微环境影响下可极化形成两种表型:促炎型(M1,经典活化型)和抗炎型(M2,选择活化型),两种表型的巨噬细胞共同调控肝脏炎症的进程和转归。因此,精确调控肝脏巨噬细胞极化有望成为防治运动诱导的肝脏炎性损伤的重要策略。二氢杨梅素(Dihydromyricetin,DHM)是一种主要存在于新食品原料显齿蛇葡萄(俗称藤茶)茎叶中的黄酮类化合物,藤茶干茎叶中DHM含量高达30%以上。研究发现,DHM具有抗氧化应激、抗肿瘤、改善糖脂代谢等多种健康保护效应,并改善四氯化碳、乙醇等化学物质诱导的肝脏炎性损伤,发挥肝脏保护作用。还有研究发现,DHM可以通过调节巨噬细胞极化,抑制胆固醇积累和炎症小体活化,防治动脉粥样硬化。但DHM对EE诱导的肝脏炎性损伤是否具有保护作用尚不清楚。此外,DHM在体内代谢过于迅速,使其对肝脏的保护作用发挥受到很大限制,因此,迫切需要寻找能延长DHM作用时间的有效手段,从而更好地发挥DHM的护肝效应。近年来,随着材料科学的发展及其与学科交叉融合的深入,多种控释给药体系在延长药物作用时间方面展现出巨大的应用前景。其中,脂质体(Liposomes)作为一种简易、高效的药物递送系统备受关注,通过在脂质体上接枝化学或生物惰性聚合物还可构建长循环脂质体,延长药物作用时间的效果。目前,已有多项研究报道脂质体递送系统可以提高植物化合物的生物利用度,并能够有效延长其发挥作用的时间。但是,基于脂质体构建DHM递送系统及其在保护运动性肝损伤中的应用研究目前尚未见相关报道。目的1、证实DHM对运动性肝损伤的保护作用;2、构建肝富集型DHM脂质体(Dihydromyricetin-Liposomes,DHM-Lipo),深入研究DHM-Lipo的缓释作用、体内分布情况和抗运动性肝损伤的效应;3、阐明DHM-Lipo在炎性环境下对肝脏巨噬细胞极化的调控作用;4、揭示沉默信息调节因子3(Silent mating-type information regulation 2 homolog 3,SIRT3)/缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1 alpha,HIF-1α)信号通路在DHM-Lipo调控巨噬细胞极化表型中的作用。方法1、采用游泳至力竭构建小鼠肝脏炎性损伤模型(简称为运动性肝损伤),腹腔注射2、4、8 mg/kg·BW/d的DHM干预3周,观察力竭小鼠体质量、肝脏指数、病理学指标、肝功能指标、血清和肝脏中的炎症因子表达,评价DHM是否具有减轻运动性肝损伤的作用,并选出DHM干预的最低有效剂量。在此基础上,降低DHM给药频率至每三天一次,探索延长DHM给药间隔Ferrostatin-1体外时间对其发挥运动性肝损伤保护作用的影响。2、基于脂质体构建DHM缓释递送体系,从DHM-Lipo的形态、粒径、体外缓释作用以及生物相容性等方面对其理化性质进行评价,并通过体内实验,对比DHM-Lipo和DHM在相同的干预条件下(每三天给药一次)对运动性肝损伤的抑制作用。进一步通过接枝荧光染料IR-808构建DHM荧光脂质体DHM-Lipo@IR-808,利用小动物活体成像和离体器官成像检测DHM-Lipo在小鼠体内的器官分布情况。3、通过DHM-Lipo@IR-808的荧光示踪,结合肝脏巨噬细胞免疫荧光染色,观察DHM-Lipo在小鼠肝脏巨噬细胞中的分布情况,探索其对肝脏巨噬细胞极化表型的调控作用。在体外实验中利用LPS刺激原代肝脏巨噬细胞和小鼠RAW264.7巨噬细胞,建立巨噬细胞炎症模型,运用流式细胞术等技术进一步探讨DHM在炎性环境下对巨噬细胞极化表型的调控作用。4、运用SIRT3特异性抑制剂、HIF-1α激动剂等,通过转录组学、qRT-PCR和免疫印迹等实验,从体内、体外探讨SIRT3/HIF-1α信号通路在DHM调节炎性环境下肝脏巨噬细胞极化表型中的作用。结果1、DHM可有效抑制小鼠运动性肝损伤,但延长DHM给药间隔时间导致DHM的保护效应显著降低。成功构建小鼠运动性肝损伤模型,主要表现为:肝脏炎性浸润加剧,谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸转氨酶(Aspartatetran saminase,AST)等肝功能指标异常,血清和肝脏组织中的肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素6(Interleukin-6,IL-6)等炎症因子表达均显著升高。DHM(2、4、8 mg/kg·BW/d)连续干预3周均可有效抑制小鼠运动性肝损伤。然而,延长最低有效剂量DHM(2 mg/kg·BW/d)干预的间隔时间为每三天干预一次时,DHM对运动性肝损伤的保护作用明显减弱,提示DHM代谢过快、体内停留时间短等问题限制了其抗运动性肝损伤作用的发挥。2、基于脂质体构建的DHM缓释递送体系可持久地发挥抗运动性肝损伤作用。成功构建理化性质稳定、生物相容性高的纳米级DHM缓释递送体系(DHM-Lipo)。相较于DHM(2 mg/kg·BW/3d)干预组,DHM-Lipo在相同干预间隔时间的情况下,仍能稳定发挥显著的抗炎护肝作用。运用近红外荧光染料IR808标记DHM-Lipo构建出荧光脂质体DHM-Lipo@IR808,示踪DHM-Lipo在小鼠器官中的分布情况。活体成像和离体器官成像检测均发现DHM-Lipo主要分布在肝脏。提示DHM-Lipo可能通过在肝脏的富集作用,在肝组织中持续缓释DHM,进而发挥更持久的抗炎作用。3、DHM-Lipo聚集于肝脏巨噬细胞,并调控巨噬细胞的免疫表型由促炎型(M1)向抗炎型(M2)极化。运用DHM-Lipo@IR808示踪,结合巨噬细胞免疫荧光染色检测发现DHM-Lipo可在肝脏巨噬细胞中聚集。通过M1/M2标志分子与巨噬细胞标志分子的免疫荧光染色或流式细胞术检测发现,力竭游泳组小鼠肝脏中M1型巨噬细胞较对照组显著增加,DHM-Lipo干预组较力竭模型组小鼠肝脏M1型巨噬细胞明显减少,而M2型巨噬细胞显著增加。在体外巨噬细胞炎症CX-5461模型中,通过流式细胞术等检测发现,DHM可以降低M1型标志分子表达水平且上调M2型标志分子表达水平,说明DHM-Lipo可聚集于肝脏巨噬细胞,并调控炎性环境下肝巨噬细胞由M1型向M2型极化。4、DHM通过SIRT3/HIF-1Interface bioreactorα相关信号通路调控巨噬细胞表型极化。DHM干预巨噬细胞炎症模型,转录组学分析发现DHM有显著抗炎作用,且调控代谢的关键分子SIRT3和HIF-1α是重要的差异表达基因。体内、体外实验验证发现炎症模型组的SIRT3表达明显受到抑制,同时HIF-1α表达升高;而DHM-Lipo和DHM干预可增加SIRT3表达,降低HIF-1α表达水平。进一步,采用SIRT3抑制剂和HIF-1α激动剂处理后,结合转录组学分析,qRT-PCR、WB、免疫荧光等检测发现,DHM可以通过激活SIRT3/HIF-1α信号通路抑制糖酵解,进而抑制巨噬细胞向M1型极化。结论本研究发现,DHM具有抑制小鼠运动性肝损伤的作用,但是代谢迅速限制了DHM抗炎作用的持久发挥。运用脂质体构建的DHM缓释递送体系DHM-Lipo通过在肝脏组织及肝巨噬细胞中的聚集作用和缓释作用延长了DHM抗炎时间。DHM可能通过抑制巨噬细胞糖酵解代谢,使其极化表型由促炎的M1型向抗炎的M2型转换,从而抑制运动性肝炎。此外,还揭示了SIRT3/HIF-1α信号通路是DHM抑制肝巨噬细胞M1型极化的关键分子机制。本研究为DHM防治运动性肝炎提供了新思路,也为DHM调控肝脏区域免疫的研究奠定了实验基础。