手性胺作为一种关键的结构单元,广泛存在于农业、医药以及精细化学品中。据估计,约有40～45%的小分子药物含有手性胺结构。利用化学法合成手性胺的合成步骤繁长、催化剂昂贵、有机溶剂用量大、副产物多、工业成本高昂。而利用酶促合成手性胺具有操作简单、立体选择性好、反应条件温和、污染小等显著优势。目前报道的可用于合成手性胺的酶有单胺氧化酶、转氨酶、亚胺还原酶等。其中,亚胺还原酶是一类利用NADPH为供氢体,催化亚胺的不对称还原以及还原胺化的新型酶。medical therapies与其他酶相比,亚胺还原酶具有优异的立体选择性selleck抑制剂以及较为宽泛的底物谱,可用于合成手性伯胺、仲胺和叔胺。本论文通过基因挖掘的手段筛选了10个亚胺还原酶,分别构建了10个重组质粒并在大肠杆菌中进行异源表达。以麦斯明为底物,利用含重组亚胺还原酶的10株基因工程菌催化合成(S)-降烟碱,最终筛选得到了一个高活性、高立体选择性的亚胺还原酶IR5,并对酶学性质进行了研究,测定其反应动力学常数为:K_m=1.286 m M,K_(cat)=0.306 s~(-1),K_(cat)/K_m=0.238 s~(-1)m M~(-1)。由于亚胺还原酶依赖NADPH,进一步通过构建亚胺还原酶与葡萄糖脱氢酶共表达质粒,实现了辅酶再生。利用含共表达质粒的重组菌全细胞催化底物浓度为50 m M的麦斯明合成(S)-降烟碱,转化2 h后,转化率由原来的27.1%提高到49.6%,转化率提高了83.0Fer-1细胞培养%。对全细胞催化的反应条件进行优化,确定了催化麦斯明不对称还原的最适反应温度为30℃,最适p H为6.0,葡萄糖含量与底物麦斯明的摩尔比为1.5:1～2:1时具有较高的催化效率。在底物浓度提高到100 m M时,转化6 h后,转化率可达60.7%。在最适反应条件下研究了底物的耐受性,并进行了初步高密度发酵,在底物浓度提高至300 m M时,转化26 h,转化率可达99.9%,e.e.值可达99.7%。在基因重组的基础上,进一步利用蛋白质工程手段对酶IR5进行了分子改造。将麦斯明、NADPH与酶IR5进行分子对接,在IR5的活性中心口袋有多个氨基酸与麦斯明发生作用。将对接复合体的氨基酸残基虚拟突变为不同的氨基酸,通过比较突变结合能的大小确定了突变位点为125和247。对125位点和247位点分别进行定点饱和突变,最终得到了一个反应初速度高于野生菌株1.14倍的突变体。但该突变体的稳定性下降,在催化300 m M底物时,转化10 h后活力基本丧失,不适用于工业生产。