类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以血管新生为主要病理特征的炎症性疾病。血管新生促进滑膜炎症和血管翳形成,加剧关节软骨和骨的破坏,在RA进程中发挥关键作用。血管生成素-2(angiopoietin-2,Ang-2),内皮细胞激活标志物,可以诱导内皮去稳定,引发血管新生。1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)是一种磷脂信号分子,由鞘氨醇激酶(sphingosine kinases,Sph Ks)催化鞘氨醇生成,通过质膜上的转运体转移至胞外,与其受体S1PR1/3结合,激活偶联的Gα_i和Gα_q,使下游磷脂酶Cβ3(phospholipase Cβ3,PLCβ3)活化。胞膜上的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate,PIP_2)被PLCβ3水解为肌醇1,4,5-三磷酸(inositol 1,4,5-trisphosphate,IP_3)和二酰甘油。IP_3向细胞质扩散,与内质网上的Ca~(2+)受体通道(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor,IP_3R)结合,诱导Ca~(2+)释放,从而触发怀布尔-帕拉德小体(Weibel-Palade body,W-P小体)胞吐Ang-2。然而,W-P小体胞吐Ang-2的方式尚未被探明。胞吐是Ang-2发挥作用的先决条件,因此,深入探究Ang-2胞吐的调控机制及其方式具有重要的意义。栀子苷(geniposide,GE)为中药栀子主要有效成分,发挥抗血管新生和抗炎作用。前期研究表明GE下调佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠血清Ang-2水平;抑制S1P/S1PR1/3信号的激活。但GE是否以及如何调控Ang-2的胞吐尚不明确。目的探究S1获悉更多P/S1PR1/3/PLCβ3/Ca~(2+)信号轴对Ang-2胞吐的调控作用以及对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)生物学功能的影响。阐明GE负调控S1P/S1PR1/3/PLCβ3/Ca~(2+)信号轴,干预Ang-2胞吐,改善HUVEC生物学功能变化,抑制RA血管新生的作用机制。方法建立AA大鼠模型,以GE和阳性药MTX干预,以关节炎指数、全身表现评分、足爪肿胀度和关节肿胀数等指标进行模型评价;采用HE染色观察AA大鼠滑膜病理形态学,彩色多普勒超声观察AA大鼠膝关节滑膜血流信号,免疫组化检测AA大鼠滑膜组织中CD31、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、S1PR1、S1PR3、PLCβ3、IP_3R和Ang-2水平。基质胶栓实验进一步探究GE对佐剂性关节炎体内血管新生的影响。以S1P诱导的HUVEC为研究对象,运用ELISA、免疫荧光、Western blot动态监测Ang-2胞吐,透射电镜观察Ang-2胞吐方式。以GE、S1PR1/3抑制剂VPC23019和IP_3R抑制剂2-APB干预,采用ELISA和免疫荧光检测Ang-2分泌,ELISA检测HUVEC胞内IP_3含量,流式细胞术检测HUVEC胞内游离Ca~(2+)水平、RT-qPCR检测S1PR1、S1PR3、PLCβ3、IP_3R和Ang-2的m RNA水平,Western blot检测S1PR1、S1PR3、PLCβ3和IP_3R蛋白表达;检测HUVEC增殖、迁移和管腔形成能力,以评价GE通过S1P/S1PR1/3/PLCβ3/Ca~(2+)信号轴对Ang-2胞吐的调控作用以及对HUVEC生物学功能的影响。结果1.GE对实验性关节炎血管新生的调控作用GE(60,120 mg/kg)显著降低AA大鼠关节炎指数、全身表现评分、足爪肿胀度和关节肿胀数,改善滑膜病理形态,减弱膝关节滑膜血流信号以及CD31和VEGF表达。AA大鼠滑膜S1PR1、S1PR3、PLCβ3、IP_3R和Ang-2异常高表达。GE给药干预可以显著抑制这些蛋白表达。以上结果提示AA大鼠滑膜组织中S1P/S1PR1/3/PLCβ3/Ca~(2+)信号轴可能被激活,诱导Ang-2胞吐,从而触发血管新生。基质胶栓实验结果显示,与对照组相比,AA组基质胶栓中血管新生明显。GE干预可以减少新生血管的形成。上述结果表明,GE可能通过调控S1P/S1PR1/3/PLCβ3/Ca~(2+)信号轴,抑制血管新生,发挥治疗RA的作用。2.S1P/S1PR1/3/PLCβ3/Ca~(2+)信号轴调控Ang-2胞吐的探究及GE干预S1P诱导HUVEC细胞中Ang-2快速胞吐。S1P(1μM)作用30 min,Ang-2大量分泌,并观察到HUVEC细胞中W-P小体融合形成囊泡,提示Ang-2胞吐方式可能为多颗粒胞吐。S1P诱导的HUVEC细胞中,Ang-2胞吐,IP_3含量以及游离Ca~(2+)水平显著增加;S1PR1、S1PR3、PLCβ3和IP_3R的m RNA和蛋白水平明显升高,Ang-2的m RNA水平则无显著性变化。GE、VPC23019和2-APB干预可以抑制S1P的作用,但对Ang-2的m RNA水平无影响。以上结果证实,S1P/S1PR1/3/PLCβ3/Ca~(2+)信号轴激活可以诱导Ang-2的胞吐。3.S1P/S1PR1/3/PLCβ3/Ca~(2+)信号轴对HUVEC生物学功能的影响及GE干预与对照组相LY294002 NMR比,S1P诱导的HUVEC增殖、迁移和管腔形成能力显著增强。与S1P组相比,GE、VPC23019和2-APB干预可以改善HUVEC生物学功能变化。表明S1P/S1PR1/3/PLCβ3/Ca~(2+)信号轴的激活诱导Ang-2胞吐,促进HUVEC生物学功能改变,触发血管新生。明确GE通过负调控S1P/S1PR1/3/PLCβ3/Ca~(2+)信号轴,干预Ang-2胞吐,抑制HUVEC生物学功能改变,从而发挥抑制血管新生的作用。结论1.GE抑制血管新生,发挥治疗RA的作用。2.S1P/S1PR1/3/PLCβ3/Ca~(2+)信号轴的激活诱导Ang-2呈多颗粒胞吐,促进HUVEC生物学功能改变,触发血管新生。3.GE负调控S1Pbio-inspired sensor/S1PR1/3/PLCβ3/Ca~(2+)信号轴,干预Ang-2胞吐,改善HUVEC生物学功能变化,抑制血管新生。