背景和目的乳腺癌(BTorin 1reast cancer,BC)是全世界女性中最常见的恶性肿瘤,也是女性因癌症死亡的最主要原因。BC占所有女性癌症病例的30%,占所有女性癌症死亡人数的15%,是女性健康的一大杀手。在过去的几十年里,尽管在早期诊断、手术、放化疗以及靶向治疗等方面取得了巨大的进步,但是目前BC的发病率与死亡率在全球绝大多数国家中仍位列第一。深入研究BC发生发展的分子机制对于进一步认识BC的生物学特性以及新靶点的筛选具有重要意义。低氧是实体肿瘤的一个重要的生物学特征,由于肿瘤细胞的过度增殖以及肿瘤血管分布的异常,包括BC在内的绝大多数实体肿瘤均存在不同程度的低氧区域。低氧与BC的代谢、增殖、迁移、侵袭及耐药等密切相关,因此研究并揭示BC细胞在低氧条件下的反应机制对于BC的治疗具有积极意义。环状RNA(circular RNA,circ RNA)是通过反向剪接形成的一类呈闭合环状结构的非编码RNA,具有细胞/组织表达特异性,高稳定性和保守性。越来越多的证据表明,circ RNA参与了多种疾病的病理过程,包括BC。然而,circ RNA在低氧条件下调控BC进展的分子机制尚未完全阐明。本研究旨在探讨低氧诱导的circ WSB1在BC中的表达模式,分析其表达量与BC患者预后的关系,同时阐明circ WSB1在低氧条件下的产生机制及其通过结合去泛素化酶USP10破坏p53的稳定性进而促进BC进展的分子机制。研究方法(1)低氧相关circ RNA的筛选及鉴定将BC细胞MCF-7置于1%O_2浓度下培养48h模拟肿瘤低氧微环境;采用Microarray分析低氧和常氧培养了48h的MCF-7细胞中差异表达的circ RNA和m RNA;采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)在低氧处理的BC细胞中对circ WSB1(hsa＿circ＿0007716)的表达进行验证;利用circ Bank和UCSC数据库分析circ WSB1的基因组信息;通过Sanger测序、PCR、Rnase R消化和放线菌素D抑制实验对circ WSB1的环状属性进行验证;采用核质分离技术分析circ WSB1的亚细胞定位。(2)circ WSB1在低氧条件下的产生机制采用q RT-PCR检测不同氧气条件以及氯化钴(Co Cl_2)对BC细胞中circ WSB1表达的影响;利用q RT-PCR检测HIF1α对BC细胞中circ WSB1表达的影响;通过JASPAR数据库分析HIF1α与circ WSB1亲本基因WSB1启动子区域可能存在的结合位点;应用双荧光素酶报告基因和染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,Ch IP)实验验证HIF1α与WSB1启动子区域的结合。(3)circ WSB1在BC组织中的表达及其与患者预后的关系采用q RT-PCR检测100对BC及癌旁组织中circ WSB1的表达;运用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic,ROC)分析circ WSB1在BC中的诊断能力;利用原位杂交(in situ hybridization,ISH)技术进一步在组织芯片中(含石蜡包埋的288例BC和123例癌旁组织)检测circ WSB1的表达,并用Kaplan-Meier法绘制BC患者生存曲线和复发曲线,同时采用多因素Cox回归模型分析影响BC患者预后的独立危险因素。(4)circ WSB1在BC细胞中的生物学作用通过细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)和克隆形成实验检测细胞在低氧条件下的增殖能力;采用Microarray分析在低氧条件下敲低circ WSB1的MCF-7细胞中差异表达的基因,并用KEGG对这些差异基因进行通路富集分析;应用蛋白质免疫印迹(western blot)检测p53及其下游的p21和Bax蛋白的表达;利用流式细胞术检测细胞周期及凋亡率;构建裸鼠皮下移植瘤生长模型观察肿瘤发生;免疫组化(immunohistochemistry,IHC)检测裸鼠移植瘤中Ki67及p53的表达;采用Kaplan-Meier法绘制荷瘤裸鼠的生存曲线。(5)circ WSB1与去泛素化酶USP10的相互作用运用RNA pull-down实验联合液相色谱-质谱(Liquid chromatograph-mass spectrometer,LC-MS)/质谱(Mass spectrometer,MS)检测与circ WSB1结合的蛋白质;采用Western blot在下拉的蛋白质中对USP10进行验证;利用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)和免疫荧光(immunofluorescence,IF)双染实验观察circ WSB1与USP10在BC细胞中的定位;运用RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)实验再次验证circ WSB1与USP10的结合;运用cat RAPID数据库分析circ WSB1与USP10相互作用的区域;采用RNA电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)、RIP及RNA pull-down实验验证circ WSB1与USP10相互作用的区域。(6)USP10与p53的相互作用及其在BC细胞中的生物学功能采用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)实验验证USP10与p53的结合;应用泛素化实验检测USP10对p53泛素化水平的影响;应用western blot检测USP10、p53及其下游p21和Bax的蛋白水平;利用CCK-8和克隆形成实验检测BC细胞增殖能力;采用流式细胞术分析BC细胞周期及凋亡率。(7)挽救实验验证circ WSB1通过结合USP10调控p53的表达进而促进BC进展采用Co-IP实验检测circ WSB1对USP10和p53结合的影响;运用泛素化实验验证circ WSB1和USP10对p53泛素化水平的影响;采用western blot技术检测circ WSB1和USP10对p53及其下游p21和Bax蛋白水平的影响;体内外功能实验验证circ WSB1和USP10对BC细胞增殖、周期及凋亡的影响。研究结果(1)circ WSB1在低氧处理的BC细胞中显著上调将MCF-7细胞置于低氧条件下培养48h后,western blot检测结果显示HIF1α显著表达,表明低氧模拟成功;利用Microarray,我们获得了常氧及低氧培养的MCF-7细胞中circ RNA及m RNA的差异表达谱。通过q RT-PCR验证,最终确认circ WSB1作为我们后续深入研究的分子。Sanger测序、PCR、Rnase R和放线菌素D抑制实验证实了circ WSB1的环状结构。核质分离实验结果显示circ WSB1主要定位于细胞核中。(2)低氧条件下HIF1α可促进circ WSB1的转录将MCF-7细胞在不同O_2浓度下培养24h以及在1%O_2浓度下培养不同时间,通过q RT-PCR发现细胞中circ WSB1的表达呈氧气浓度及低氧时间依赖性。同时,circ WSB1的表达呈Co Cl_2浓度及处理时间依赖性。此外,q RT-PCR和western blot结果显示,在低氧条件下,过表达HIF1α后,circ WSB1的表达上调,而敲低HIF1α后,circ WSB1的表达下调。通过JASPAR数据库分析发现,circ WSB1亲本基因WSB1启动子区域具有4个HIF1α结合位点,双荧光素酶报告基因和Ch IP实验结果显示,在低氧条件下,HIF1α能够与WSB1启动子结合。(3)circ WSB1在BC组织中的表达水平升高且不利于患者的预后采用q RT-PCR检测100对BC及癌旁组织中circ WSB1的表达,发现circ WSB1在BC组织中显著上调。ROC曲线表明circ WSB1在BC中有较高的诊断能力。此外,ISH结果也显示,circ WSB1在BC组织中显著上调,其表达与BC患者的预后呈负相关。多因素Cox回归模型显示,circ WSB1的表达量可作为BC患者预后的一个独立危险因素。(4)circ WSB1可促进BC细胞增殖CCK-8和克隆形成实验结果表明,在低氧条件下,过表达circ WSB1可显著促进BC细胞增殖,而敲低circ WSB1则呈现相反的作用。Microarray差异基因分析和KEGG通路富集分析发现在低氧处理的MCF-7细胞中敲低circ WSB1后p53信号通路出现了显著富集。Western blot结果显示,在低氧处理的BC细胞中过表达circ WSB1后,p53及其下游的p21和Bax的表达降低,而敲低circ WSB1后,它们的表达升高。流式细胞术结果显示,在低氧处理的BC细胞中敲低circ WSB1可导致细胞周期阻滞和细胞凋亡。体内实验结果Bio finishing显示,过表达circ WSB1能够促进裸鼠移植瘤的生长,敲低circ WSB1则明显抑制移植瘤生长。IHC结果显示,circ WSB1过表达组移植瘤中增殖指数Ki67的表达升高,p53的表达降低,而在circ WSB1敲低组中,这两个蛋白的表达呈现出相反的趋势。此外,荷瘤裸鼠生存分析显示,circ WSB1的表达量与裸鼠的生存时间呈负相关。(5)circ WSB1可与USP10相互作用RNA pull down联合LC-MS/MS分析共获得141个蛋白能够与circ WSB1结合,最终我们聚焦到USP10。FISH和IF双染实验显示,circ WSB1和USP10存在共定位。此外,RIP结果进一步证实了circ WSB1与USP10的结合。利用cat RAPID数据库分析发现circ WSB1的第25-126nt能够与USP10的第1-100aa结合。然后我们利用RNA EMSA、RIP和RNA pull-down实验证实了circ WSB1和USP10的相互作用区域。(6)USP10通过结合并稳定p53进而抑制BC细胞增殖Co-IP实验结果显示,USP10通过其第1-100aa与p53相互结合。泛素化实验表明,在低氧条件下,过表达USP10能够显著抑制p53泛素化,而敲低USP10则明显增强了p53的泛素化水平。CCK-8和克隆形成实验结果显示,在低氧条件下,过表达USP10抑制BC细胞增殖,而敲低USP10则可显著促进细胞增殖。流式细胞术结果显示,在低氧处理的BC细胞中,过表达USP10可导致细胞周期阻滞,促进细胞凋亡。(7)circ WSB1通过结合USP10调控p53的表达进而促进BC进展Co-IP实验结果显示,过表达circ WSB1能够抑制USP10与p53的结合。泛素化实验PUN30119溶解度显示,在低氧条件下,过表达USP10能够逆转上调circ WSB1引起的p53泛素化增加,而敲低USP10能够逆转下调circ WSB1引起的p53泛素化降低。Western blot实验结果显示,circ WSB1导致的p53及其下游p21和Bax水平的变化也能被USP10逆转。此外,功能实验结果表明,circ WSB1在体内外引起的生物学效应均能够被USP10逆转。研究结论在低氧条件下,HIF1α能够显著诱导circ WSB1的表达。在BC组织中,circ WSB1的表达显著高于癌旁组织,并且其表达量与患者的预后呈负相关。体内外功能实验表明,circ WSB1能够促进BC细胞增殖。机制上,低氧诱导的circ WSB1通过竞争性结合USP10,从而抑制其对p53的去泛素化作用,破坏p53的稳定性,进而促进BC进展。