停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)是引发人或动物多种疾病的病原微生物之一,可以定植在健康动物的体内,特别是在动物的消化道和生殖器区域。停乳链球菌可以从患有乳腺炎的奶牛乳汁中分离得到,导致牛奶中乳脂、乳糖、乳蛋白含量降低,严重的还会导致血乳的出现,威胁食品和公共卫生安全。经证实,停乳链球菌在牛奶培养基中前期生长速度快于脑心浸液肉汤培养基,但其在牛奶中生长机理和适应性机制缺乏系统的研究。因此,本研究以停乳链球菌为研究对象,主要基于转录组测序(RNA-Seq)、转座子突变库构建、基因敲除等方法,从基因组水平上探究其牛奶适应性机制。selleck NMR主要的研究内容及结论如下:(1)对患乳腺炎奶牛的奶样中分离到的菌株进行全基因测序,并将该菌株命名为停乳链球菌SD24。通过编码基因预测和注释,共有2107个基因注释到基因组。此外,利用通用基因功能数据库对菌株编码基因功能进行注释,为后续的功能基因组学分析和研究提供了信息基础。(2)在基因组数据的基础上,利用了ATP bioluminescenceRNA-Seq技术对SD24在牛奶条件下的差异表达基因进行研究。在牛奶条件下共有936个显著性差异表达基因,其中有14个转录增强基因与半乳糖代谢有关,通过KEGG半乳糖代谢通路图和差异基因分析,选择上调178倍的SD24＿Lac D1基因进行敲除验证。(3)SD24中某些基因的失活可能会影响其在牛奶里的生长,为了筛选在牛奶条件下生长能力弱的突变株Bafilomycin A1细胞培养,成功构建了基于转座子随机插入的基因失活文库。随机挑3360个突变株接种到含有1%溴甲酚紫的牛奶中(变色能力弱的突变株即代表其生长速度减慢),发现一株生长变慢突变株(SD24Δ1908::gm),并验证其失活基因为菱形家族膜内蛋白酶编码基因。(4)为进一步证明SD24＿Lac D1基因为牛奶适应性基因,利用sac B反筛系统成功敲除了编码塔格糖二磷酸醛缩酶基因,生成菌株SD24Δ895,并对缺失株的特性进行了研究。发现SD24Δ895代谢乳糖和半乳糖代谢能力降低,与转录组中半乳糖代谢通路分析结果一致。SD24Δ1908::gm菌株与野生型进行竞争实验时,发现在牛奶条件下该突变株的生存能力不如野生型,并且发现该突变株还降低了多种糖的代谢能力。不仅说明了SD24＿1908可以帮助停乳链球菌可以在牛奶中更好地生长,突变株的多种糖的代谢能力降低还初步解释了该基因的在牛奶中生长的机制,为预防和治疗奶牛乳腺炎提供药物靶点和理论支撑。