黄原胶是由野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)生产的一种复杂胞外多糖。自1968年获得“公认安全”(GRAS)批准以来,由于其独特的流变性能以及良好的稳定和增稠效果,黄原胶作为食品添加剂的应用越来越广泛。通过水解黄原胶制备的黄原胶寡糖(XGOS)具有抗氧化、抗凋亡、益生等特殊生物活性,具有很高的附加值和广阔的应用前景。酶法水解黄原胶具有反应条件温和、过程可控等优点,但特异性酶较难获取,且黄原胶的大分子特性导致其酶解效率较低。针对以上问题,本研究将骆驼瘤胃元基因组来源的内切β-1,4-葡聚糖酶(Persi Cel4)在毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)中表达,并与野油菜黄单胞菌(X.campestris CCTCC M2015714)建立耦合发酵体系一步法制备XGOS。最后对XGOS进行分离提取、结构表征及生物活性研究。主要研究成果如下:(1)Wnt-C59通过异源表达骆驼瘤胃元基因组来源的Persi Cel4,构建了重组毕赤酵母GS115-p PIC9K-persi Cel4,随后对其发酵条件进行优化,并研究了Persi Cel4酶学性质。结果显示,重组毕赤酵母摇瓶水平的最佳发酵条件为p H 6.0、28℃、装液量20%、甲醇添加量1.5%,在7 L发酵罐中Persi Cel4活力达到17.97 U·m L~(-1)。Persi Celhuman biology4的最适催化条件为p H 7.0、75℃,能直接水解商品黄原胶得到重均分子量为1536 Da的XGOS-1,其在水解产物中占比48.17%。此外,通过在野油菜黄单胞菌发酵过程中流加Persi Cel4酶液,建立了一种新型XGOS生产策略,最终获得重均分子量为1808 Da的XGOS-2,占水解产物的51.50%。(2)建立了重此网站组毕赤酵母与野油菜黄单胞菌的耦合发酵体系,毕赤酵母分泌的Persi Cel4直接水解野油菜黄单胞菌生产的黄原胶来一步法制备XGOS。进一步对耦合发酵条件进行优化,最佳发酵条件为:野油菜黄单胞菌单独发酵36 h后,将4倍(v·v~(-1))接种量的毕赤酵母接入发酵体系,控制此阶段p H为7.0,每24 h添加发酵液体积0.75%的甲醇至发酵结束。摇瓶水平中耦合发酵体系的总糖最高为11.40 g·L~(-1),产物中重均分子量为2500 Da的XGOS-3占比93.79%;在7 L发酵罐中,耦合发酵体系的总糖最高达到17.85 g·L~(-1),其中低分子量黄原胶(52 030 Da)占96.64%。(3)对上述三种方法(常规水解、流加酶液和耦合发酵)制备得到的XGOS-1、XGOS-2和XGOS-3进行提取纯化,通过单糖组成分析、MALDI-TOF MS分析、FT-IR光谱及NMR光谱对其结构进行解析,确定了XGOS-1的聚合度为8和9,XGOS-2的聚合度为5和10,XGOS-3的聚合度为14。三种XGOS均具有较高的抗氧化活性,当XGOS-1浓度为5 g·L~(-1)时,DPPH自由基清除率达到76.47%,当XGOS-3浓度为5 g·L~(-1)时,羟自由基清除率达到89.74%。体外益生菌发酵实验表明XGOS可有效促进某些肠道益生菌的生长,并且生成有益肠道健康的短链脂肪酸和乳酸。