目的:1.通过临床研究初步评价冠脉通颗粒治疗稳定性心绞痛(Stable angina pectoris,SAP)痰瘀互结证的有效性与安全性。2.通过网络药理学对冠脉通颗粒治疗动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)的潜在作用机制进行探索,为实验研究提供理论依据。3.通过实验研究观察冠脉通颗粒对Apo E~(-/-)小鼠AS模型斑块和炎症免疫反应的影响,并对相关通路进行验证,明确冠脉通颗粒对AS的影响和机制。方法:1.临床研究收取山东中医药大学附属医院门诊2021年07月-2022年07月符合纳入标准的稳定性心绞痛痰瘀互结证患者,随机分为对照组和试验组。同期健康体检者为健康对照组。对照组给予常规西药治疗,试验组在常规西药治疗方案上加服冠脉通颗粒。干预周期为8周。健康对照组为空白对照,不给予任何特殊干预。观察对照组和试验组治疗前后的中医证候积分和疗效、心绞痛疗效、硝酸甘油停减率、心电图疗效等指标的变化。并对受试者血脂和血清Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)、白介素-18(Interleukin-18,IL-18)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)等指标的水平进行检测。2.网络药理学研究采用中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)、HERB和Gene Cards数据库筛选冠脉通颗粒治疗AS的潜在作用靶点。通过Metascape在线分析工具构建蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-Protein Interaction,PPI)网络,并进行基因本体论(Gene Ontology,GO)生物学过程(Biological process,BP)富集分析、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析和分子复合物检测(Molecular complex detection,MCODE)模块分析,对冠脉通颗粒治疗AS的作用机制进immune sensing of nucleic acids行探讨。3.实验研究将48只Apo E~(-/-)小鼠和18只C57BL/6J小鼠普通饲料适应性喂养1周后,C57BL/6J小鼠继续以普通饲料喂养;Apo E~(-/-)小鼠以高脂饲料喂养,建立AS模型。连续喂养16周后,随机选取3只Apo E~(-/-)小鼠和3只C57BL/6J小鼠验证模型。造模成功后,将剩余Apo E~(-/-)小鼠随机分为模型组(MOD)、冠脉通颗粒组(GMTG)和阿托伐他汀组(ATO),每组15只。剩余15只C57BL/6J小鼠为正常对照组(NC)。正常对照组给予普通饲料喂养,同时每天以0.9%生理盐水0.2ml/20g灌胃;模型组、冠脉通颗粒组和阿托伐他汀组均给予高脂饲料喂养,每天分别给予0.9%生理盐水、冠脉通颗粒和阿托伐他汀0.2ml/20g灌胃。干预8周后,通过摘除眼球取血,分离血清,检测血清总胆固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(Low Density Lipoprotein Cholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(High Density Lipoprotein Cholesterol,HDL-C)水平;酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immuno Sorbed Assay,ELISA)检测血清白介素-6(Interleukin 6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-18、IL-1β和氧化低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)水平;取主动脉胸段进行大体油红染色;取主动脉根部进行苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)、油红染色和Movat染色,定量分析斑块内脂质、胶原纤维和泡沫细胞含量;取主动脉根部进行免疫组织化学染色,检测斑块内TLR4、髓样分化因子88(Myeloid differMDV3100价格entiation factor 88,My D88)、核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)、NLRP3和半胱氨酸蛋白酶-1(Cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase-1)蛋白的表达;蛋白质免疫印迹法(Western blot,WB)检测主动脉组织TLR4、My D88、NF-κB、NLRP3和Cleaved caspase-1蛋白的表达;q PCR检测主动脉TLR4、My D88、NF-κB、NLRP3和caspase-1 m RNA的表达。结果:1.临床研究结果表明,与对照组相比,试验组患者治疗后的中医证候积分明显减少,中医证候疗效和心绞痛疗效明显提高(P<0.05)。从单一证候疗效来看,试验组和对照组胸痛、胸闷、心悸、气短、痰多、舌苔厚腻等证候均有不同程度的改善,试验组改善程度普遍优于对照组(P<0.05)。两组患者的硝酸甘油停减率和心电图疗效未见明显差异(P>0.05)。试验组治疗后血清TC、TG、LDL-C水平明显降低,HDL-C水平明显升高;对照组治疗后血清TC、LDL-C水平明显降低,HDL-C水平明显升高,试验组对血脂的调节优于对照组(P<0.05)。两组患者治疗后的血清TLR4、NLRP3、IL-18和IL-1β水平均明显下降,试验组下降程度更为明显(P<0.05)。试验组与对照组相比,红细胞(Red blood cell,RBC)、白细胞(White blood cell,WBC)、血小板(Platelet,PLT)、血红蛋白(Hemoglobin,HGB)、丙氨酸氨基转移酶(Alanine transaminase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate transaminase,AST)、肌酐(Creatinine,Cr)以及尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)水平无明显差异,两组患者在治疗期间均未出现药物不良反应。2.网络药理学分析结果表明,冠脉通颗粒可能通过调控337个潜在作用靶点而发挥AS治疗作用,其机制可能与炎症反应、细胞迁移的正调节、细胞因子产生的正调节、对细菌来源分子的反应、对无机物质的反应和对伤害的反应等多个生物学过程的调节有关。主要涉及的通路包括癌症通路、脂质和动脉粥样硬化通路等。其中脂质与动脉粥样硬化通路不仅富集程度较为显著,也与Toll样受体信号通路和NOD样受体信号通路存在同一聚类树中,提示Toll样受体信号通路和NOD样受体信号通路可能与AS之间存在一定程度的相关性。MCODE模块分析结果也表明,癌症通路、白细胞介素信号、免疫系统中的细胞因子信号和My D88相关Toll样受体信号的传导等模块均与炎症和免疫反应相关,与富集分析结果大致相符。结合富集分析结果中的TLR4/NF-κB、NLRP3/Caspase-1及下游IL-1β、IL-6、TNF-α等靶点,提示TLR4和NLRP3介导的炎症免疫反应可能在冠脉通颗粒治疗AS的过程中发挥了重要作用。3.实验研究结果表明,高脂饲料喂养16周,可成功建立Apo E~(-/-)小鼠AS模型,主动脉胸段油红染色可见明显AS斑块形成,主动脉根部HE染色可见胆固醇结晶和炎症细胞浸润。ELISA检测结果表明,与NC组相比,MOD组小鼠血清IL-18、IL-1β、IL-6和TNF-α水平明显升高(P<0.05);与MOD组相比,GMTG组和ATO组的IL-18、IL-1β、IL-6和TNF-α水平明显下降(P<0.05);GMTG组和ATO组IL-18、IL-1β、IL-6和TNF-α水平无明显差异(P>0.05)。从血脂水平看,与NC组相比,MOD组TC、TG、LDL-C和ox-LDL水平明显升高,HDL-C水平明显降低(P<0.05);与MOD组相比,GMTG组TC、TG、LDL-C和ox-LDL水平明显降低,HDL-C水平明显升高(P<0.05),ATO组TC、LDL-C和ox-LDL水平明显降低(P<0.05),TG和HDL-C无显著差异(P>0.05);GMTG组HDL-C水平高于ATO组(P<0.05),差异具有统计学意义,两组TC、TG、LDL-C和ox-LDL均无明显差异(P>0.05)。主动脉根部油红染色分析结果表明,NC组主动脉根部管壁无AS斑块形成,MOD组、GMTG组和ATO组均有AS斑块形成,脂质沉积明显;与MOD组相比,GMTGZ-IETD-FMK供应商组和ATO组斑块脂质沉积面积均有不同程度的减轻(P<0.05);GMTG组和ATO组无明显差异(P>0.05)。Movat染色结果表明,NC组无明显斑块形成,MOD组、GMTG组和ATO组均可见斑块成分的变化;与MOD组相比,GMTG组和ATO组斑块中的胶原纤维含量增加,泡沫细胞含量减少(P<0.05);GMTG组和ATO组胶原纤维和泡沫细胞含量无明显差异(P>0.05)。免疫组化染色结果表明,与NC组相比,MOD组小鼠主动脉组织TLR4、My D88、NF-κB、NLRP3和caspase-1蛋白表达均明显升高(P<0.05);与MOD组相比,GMTG组和ATO组的TLR4、My D88、NF-κB、NLRP3和caspase-1蛋白表达均明显下降(P<0.05);与ATO组相比,GMTG组NLRP3蛋白下降更明显,差异具有统计学意义(P<0.05),两组TLR4、My D88、NF-κB和caspase-1蛋白无明显差异(P>0.05)。WB实验结果表明,与NC组相比,MOD组小鼠主动脉组织TLR4、My D88、NF-κB、NLRP3和Cleaved caspase-1蛋白表达量均明显升高(P<0.05);与MOD组相比,GMTG组和ATO组的TLR4、My D88、NF-κB、NLRP3和Cleaved caspase-1蛋白表达均明显下降(P<0.05);ATO组NF-κB蛋白表达明显降低(P<0.05),两组TLR4、My D88、NLRP3和Cleaved caspase-1蛋白表达无明显差异(P>0.05)。PCR结果表明,与NC组相比,MOD组小鼠主动脉组织TLR4、My D88、NF-κB、NLRP3和caspase-1 m RNA表达均明显升高(P<0.05);与MOD组相比,GMTG组和ATO组的TLR4、My D88、NF-κB、NLRP3和caspase-1 m RNA表达均明显下降(P<0.05);GMTG组TLR4 m RNA表达明显降低,ATO组caspase-1 m RNA表达明显降低,差异均具有统计学意义(P<0.05),两组My D88、NF-κB和NLRP3 m RNA表达无明显差异(P>0.05)。结论:1.冠脉通颗粒联合西医治疗能够有效的降低稳定性心绞痛痰瘀互结证患者的中医证候积分,改善中医证候和心绞痛症状,无明显不良反应。还能够调节脂质代谢、降低血清TLR4、NLRP3、IL-1β和IL-18水平,具有调脂和抑制炎症免疫反应的作用。2.冠脉通颗粒能够有效改善AS小鼠的血脂代谢,促进斑块重塑,增加斑块稳定性,并可能通过抑制TLR4/My D88/NF-κB通路表达和NLRP3炎症小体活化,改善AS小鼠的炎症免疫反应。