陕北白绒山羊是我国优良的绒山羊品种,其羊绒产业是陕北地区的主导产业之一,在振兴区域经济和助农增收中发挥着重要作用。陕北白绒山羊羊绒的产量、长度、纤维细度等均属国内先进水平,具有重要的经济价值。胚胎时期毛囊的形态发生对于成年后绒山羊的产绒性状等具有决定性作用。因此,探究绒山羊胚胎期毛囊形态发生的分子调控机制对于深度解析毛囊形态发生过程、绒山羊的分子辅助育种具有重要意义。毛囊结构复杂,涉及多种细胞类型及不同细胞类型之间的信号交流和众多基因的时空表达,这些基因的时空表达是众多调控因子相互作用的结果。随着单细胞转录组测序技术的发展,相关单细胞测序技术、单细胞染色质可及性区域测序技术(single cell assay for transposase accessible chromatin with high-throughput sequencing,scATAC-seq)和空间转录组测序等也快速的发展,为深入挖掘毛囊形态发生过程中关键基因的空间位置信息及信号通路等提供了强有力的技术支持。因此,本研究首先利用scATAC-seq技术构建了小鼠毛囊形态发生的染色质可及性图谱,并通过离体组织培养进行验证,然后以小鼠毛囊形态发生的染色质可及性图谱为参考,构建了绒山羊毛囊形态发生的染色质可及性图谱;最后利用10×Genomic chromium空间转录组测序技术对陕北白绒山羊毛囊形态发生过程中重要基因在毛囊中的空间位置进行描绘,并进一步利用组织免疫荧光进行验证。本研究获得的主要结果如下:(1)在单细胞水平构建小鼠毛囊形态发生的染色质可及性图谱;成功鉴定出纤维细胞、角化细胞、血管内皮细胞等细胞类型,并分析了不同细胞类型之间的差异染色质可及性和基因活性(皮肤主要是由真皮层和表皮层构成,将真皮层的细胞划分为纤维细胞,表皮层的细胞划分为角化细胞);不同细胞类型之间的差异表达基因与基因活性的相关性分析发现,在毛囊诱导期,Col1a1、Col1a2、Lum、Dcn、Twist1和Twist2等在纤维细胞中高表达且具有较高的基因活性;Krt14、Krt15、Krt17、Krt5、Krt7和Krt8等在角化细胞中高表达且具有较高的基因活性。在毛囊器官形成期,Twist2、Tcf4、Prrx2、Tbx18、Col1a1、Prrx1、Col1a2和Twist1等在纤维细胞中高表达且具有较高的基因活性;Gata3、Wnt7b、Wnt10a、Wnt10b、Lef1、Pou2f3、Rxra和Sox15等在角化细胞中高表达Immunologic cytotoxicity且具有较高的基因活性。在毛囊分化阶段,Col1a1、Col1a2、Ebf1、Fgfr1、Notch2、Prrx1、Prrx2和Rspo3等在纤维细胞中高表达且具有较高的基因活性;Bmp2、Dmkn、Krt5、Krt14、Krt15、Wnt7b、Lhx2和Wnt10b等在角化细胞中高表达且具有较高的基因活性。进一步通过转录因子motif富集分析和motif足迹分析,筛选到在毛囊诱导期、器官形成期和分化期基因表达和基因活性一致,且motif活性一致的Twist2的motif MA0633.1,差异peak可视化也发现Twist2启动子区存在差异peaks位点。基于scATAC-seq和sc RNA-seq联合分析结果,对毛囊诱导期差异表达且染色质可及性存在差异的基因Enpp2、Twist2、Wnt10b和Edar进行体外试验验证,免疫荧光结果发现在离体培养的皮肤组织中干扰Enpp2、Twist2、Wnt10b和Edar后,毛囊的真皮聚集(dermal condensates,DC)和基板结构(placode,Pc)形成受阻,表明Enpp2、Twist2、Wnt10b和Edar等在毛囊的结构形成过程中发挥重要作用。(2)小鼠毛囊形态发生过程中不同阶段纤维细胞和角化细胞染色质可及性分析和motif富集分析,成功富集到Twist2、Junb、Nfatc1、Lef1、Lhx2和Sox9等真皮和表皮发育有关的转录因子。整合后的纤维细胞和角化细胞可再分群为DC、DP、pre-Pc、Pc和HFSCs等,并对不同亚群进行染色质可及性分析。(3)在单细胞水平构建陕北白绒山羊毛囊形态发生相关染色质可及性图谱,成功鉴定出纤维细胞、角化细胞、血管内皮细胞等细胞类型,并分析SBE-β-CD作用了不同细胞类型之间的差异染色质可及性和基因活性。在毛囊诱导期,Col1a1、Col1a2、Pdgfra、Col6a2、Tcf4、Dcn、Tbx18、Enpp2和Notch2等在纤维细胞中具有较高的基因活性;KrRapamycin使用方法t14、Krt71、Krt17、Vdr、Ovol1、Wnt6、Wnt10a、Wnt4、Krt80、Krt15、Krt7、Krt19、Krt85、Wnt7a、Wnt7b和Edar等在角化细胞中具有较高的基因活性。在毛囊器官形成期,Col1a1、Col1a2、Col5a2、Col6a3、Dkk2、Enpp2、Tcf4和Ebf2等在纤维细胞中具有较高的基因活性;Krt14、Krt71、Krt17、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Krt80和Krt5等在角化细胞中具有较高的基因活性。在毛囊分化期,Col1a2、Col6a2、Col6a3、Lox、Tcf4、Dcn、Tbx18、Enpp2和Notch2等在纤维细胞中具有较高的基因活性;Krt14、Krt71、Krt17、Vdr、Ovol1、Lhx2、Wnt6、Wnt10a和Wnt4等在角化细胞中具有较高的基因活性。(4)构建了绒山羊毛囊形态发生的单细胞空间转录图谱。利用UMAP降维、聚类和分群等,可视化了基因在毛囊中的空间分布位置,发现Col1a1、Dcn、Dlk1、Thbs2、Thbs4和Zfhx4等基因在绒山羊毛囊诱导期皮肤组织中广泛表达。在毛囊器官形成期,Krt1在表皮附近高表达,Krt15在毛钉周围高表达,CD34和Postn在毛囊周围也显著表达,Col1a1和Col1a2在毛囊间充质中高表达。在毛囊分化期,Hes1在转运扩增细胞(transit-amplifying cells,TAC)中高表达,Krt1、Krt10和Krt17在表皮中高表达,Krt40、Krt71、Krt14、Krtap3-1、Sox9、Lhx2、Lef1和VDR在毛囊周围高表达。同时利用组织免疫荧光验证了Lef1、Krt15、Ctnnb1、Bmp2、Vdr和PCNA等关键基因的组织定位情况,定位结果与先前的研究结果一致。综上所述,本研究构建了小鼠和陕北绒山羊毛囊形态发生的染色质可及性图谱,进一步构建了陕北白绒山羊空间转录图谱,结合课题组前期sc RNA-seq结果构建了毛囊形态发生的转录调控图谱和分子特点,并对其中的关键基因的表达和空间分布等进行了验证。本研究丰富了毛囊形态发生的调控机制,为解析绒山羊胚胎期毛囊发育的分子调控机制及绒山羊的分子辅助育种等提供理论依据。