副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种革兰氏阴性嗜盐菌,广泛存在于海洋、海岸、河口等环境。作为一种重要的人兽共患病病原菌,副溶血性弧菌感染不仅会引起对虾的急性肝胰腺坏死病,还可以引发人的急性胃肠炎,严重时还会导致败血症、坏死性筋膜炎和伤口感染等,给全球的养殖业和公众健康带来了巨大困扰和严重威胁。过渡态金属是几乎所有生物的必需营养元素,锌(Zn)是细菌中第二丰富的微量元素,可以作为多种蛋白和酶的辅因子发挥催化和调节的作用,但过量的锌又具有毒害作用,宿主可以利用营养免疫来捕获病原菌周围的锌,使其不能被病原菌利用,或通过施加锌毒性来对抗病原菌的感染。当然细菌也进化出了一些机制来维持菌体内的锌稳态,进而抵抗宿主细胞的防御措施。本研究通过RNA测序分析探讨副溶血性弧菌在Zn限制与Zn充足条件下的转录谱,筛选出Zur调节子调控的三种假定Zn摄取系统,分别为ZnuABC、ZnuABC Ⅱ和ZrgABCDE系统。通过荧光定量PCR验证了三种系统中编码Zn结合蛋白的基因(zrgA、znuA、znuA Ⅱ)在缺Zn条件下的表达,结果与RNA测序结果一致,三种基因的表达均显著上调。对此,构建了相应的单基因缺失株AzrgA、ΔznuAⅡ,双基因缺失株ΔzrgAΔznuA、ΔzrgAΔznuA Ⅱ、ΔznuAΔznuAⅡ和三基因缺失株ΔzrgAΔznuAΔznuA Ⅱ及ΔzrgA的基因互补株CΔzrgA,并通过生长曲线测定各菌株在不同条件下的生长情况。结果显示,在缺 Zn 条件下,ΔzrgA、ΔzrgAΔznuA、ΔzrgAΔznuA Ⅱ、ΔzrgAΔznuAΔznuA Ⅱ菌株均表现出明显的生长缺陷,且ΔzrgAΔznuA、ΔzrgAΔznuAⅡ、ΔzrgAΔznuAΔznuA Ⅱ菌株比ΔzrgA的生长缺陷更为明显,而ΔznuAΔznuAⅡ双基因缺失株的生长与WT菌株相比并没有差异,表明副溶血性弧菌中zrgA为主要的Zn摄取基因,而znuA和znuAⅡ则起次要作用。通过运动性试验及荧光定量PCR分析zrgA对副溶血性弧菌运动能力的影响,结果显示,在缺锌条件下,ΔzrgA的泳动能力显著降低,但突变株中与泳动能力相关的极性鞭毛基因的表达并没有下调。因此,在ΔzrgA中观察到的泳动能力下降可能是生长缺陷所导致。通过斑马鱼感染模型研究zrgA对副溶血性弧菌致病性的影响,结果显示,zrgA对副溶血性弧菌的致病性没有影响。通过荧光定量PCR和β-半乳糖苷酶活性测定分析Zur对zrgA的调控作用,结果显示,在Δzur中zrgA基因的表达显著上调;且携带pDM8-PzrgD-zrgE质粒的Δzur的β-半乳糖苷酶活性显著高于携带相同质粒的WT菌株。结果表明,Zur抑制zrgA的表达,并在Zn缺乏条件下解除限制。以上结果表明,副溶血性弧菌响应Zn限制上调Zur调节子的表达,且更依赖ZrgABCDE系统来进行Zn的摄取。由RNA测序结果可知,在Zn限制条件下,VP_RS04700(zntA)基因下调最为显著,推测其与副溶血性弧菌的Zn外排有关。通过荧光定量PCR分析zntA在不同金属胁迫条件下的表达情况,结果显示,zntA在Zn、Cu、Co、Ni过量条件下均呈现出不同程度的上调。对此,构建了基因缺失株ΔzntA与互补株CΔzntA,通过生长曲线分析各菌株在不同条件下的生长情况,结果显示,ΔzntA菌株对过量的Zn和Ni敏感。由于金属之间存在毒性中和作用,检测了 ZHBeAg hepatitis B e antigenn毒性是否可以由其他金属中和,结果表明,在Zn过量的情况下向培养基中添加亚铁离子可以恢复其生长。稀释点板结果显示,在使用过量的Zn或Ni处理3 h后,ΔzntA菌株在平板上形成的菌落数没有减少,表明Zn和Ni对ΔzntA菌株的生长抑制效果为抑菌作用。通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)分析各菌株在不同生长条件下的金属含量,结果显示,ΔzntA菌株体内Zn的积累量显著高于WT和CΔzntA菌株,表明zntA为副溶血性弧菌中Zn的外排泵;在Ni过量的条件下,ΔzntA菌株体内Ni的积累量与WT相比无差异,而Zn的积累量却显著提高,且三种菌株在Ni过量的条件下,在培养基中添加TPEN去除Zn之后的生长没有差异,表明ΔzntA菌株在Ni过量条件下的生长缺陷是由于Zn过量积累引起的。同时,在Zn存在的条件下,ΔzntA菌株对H2O2诱导的氧化应激更为敏感。竞争感染实验显示,ΔzntA菌株在副溶血性弧菌感染过程中的竞争能力显著降低。通过荧光定量PCR和β-半乳糖苷酶活性测定分析ZntR对zntA的调控作用,结果显示,ΔzntR菌株中zntA的表达量显著降低;携带pDM8-PzntA质粒的WT菌株的β-半乳糖苷酶活性显著高于携带相同质粒的ΔzntR菌株,且携带pDM8-PzntA质粒的WT菌株在Zn、Cu、Co、Ni条件下孵育后表现出的β-半乳糖苷酶活性均显著高于正常条件,表明ZntR正向调节zntA的表达,并响应Zn、Cu、Co、Ni的诱导。以上Bucladesine体内结果表明,副溶血性弧菌中ZntR激活zntA的表达来进行Zn的外排,且zntA介导的Zn外排与副溶血性弧菌的氧化应激耐受和致病性相关。综上所述,本研究通过RNA测序分析筛选鉴定出副溶血性弧菌中的Zn摄取及外排相关基因,并对其生物学功能进行探究,揭示了副溶血性弧菌维持Zn稳态的相关机制,为后续开发基于金属的抗菌方案来管理传染AY-22989纯度病提供理论基础。