研究背景及目的癌症已经发展成为威胁全球人类健康的首要因素,其中,白血病在2022年全球范围内的预计新发病例和预计死亡病例都位于前十位,并且白血病是一种最主要的儿童癌症,约占新诊断儿童癌症的28%,严重威胁成人和青少年健康。随着靶向治疗药物的使用,白血病患者的5年生存率得到大幅度提升,但是对于如何及时发现和诊断白血Y-27632浓度病仍然是一个薄弱环节,因此需要寻找并开发更多有效的生物标记物来帮助白血病的预防与诊断。单核苷酸多态性(SNP)位点在癌症风险预测、诊断、治疗等过程中有重要潜力,全基因组关联研究(GWAS)已经确定了数百个与白血病风险相关的SNP。然而,这些疾病易感性的遗传变异大多集中在基因非编码区,由于这些非编码变异不直接影响基因编码,使得阐明它们在疾病发生和发展中的调控机制尤其具有挑战性。同时由于白血病相关的细胞大多为悬浮生长细胞系,基因递送效率也成为了其体外功能研究的限制因素。因此绝大数的白血病风险相关SNP的生物学功能和致病机制尚不明确。本课题研究的主要目的是通过一种高效的并行报告基因分析系统筛选鉴定具有潜在基因调控活性的白血病风险相关SNP,并深入探究这些功能性风险位点导致疾病易感性的机制,提供功能性白血病风险位点细致的基因功能注释,为白血病的诊断和治疗提供潜在的生物标记物,也为其在临床治疗中的应用提供有力的证据支持。同时,为了解决白血病细胞系转染效率低的问题,我们开发了基于膜锚定亲和分选标签的细胞分选系统,可有效促进白血病细胞的基因功能研究。研究结果1.并行报告基因分析鉴定多个功能性白血病风险SNP位点我们在白血病细胞系K-562细胞中对226个白血病GWAS SNP的等位基因进行了 DiR-seq报告基因分析,从226个标签SNP中筛选出85个具有显著等位PLX3397供应商基因差异的基因调节性SNP位点。在较为显著的55个调控SNP位点中,16个SNP的风险等位基因的转录活性低于参考等位基因,39个SNP的风险等位基因的转录活性高于参考等位基因。为了阐明功能性SNP导致白血病遗传易感性的生物学基础,我们结合基因组学和表观遗传组学数据,评估了白血病细胞系中风险SNP所在区域的染色质开放状态(FAIRE-seq)、可及性(ATAC-seq和DNase-seq)和组蛋白修饰状态(H3K4me1,H3K4me3 和 H3K27ac ChIP-seq),并在 K-562细胞中通过FAIRE-qPCR实验进行了验证,选出rs1388941和rs68586medical waste98进行系统的功能和机制研究。2.基因调节性SNP rs1388941导致白血病风险的机制针对功能性SNP rs1388941,我们在K-562细胞中通过DiR-qPCR分析和双荧光素酶报告基因分析,发现风险等位基因G能够显著上调增强子活性。基于ChIP-seq、DNase-seq、FAIRE-seq 和 ATAC-seq 的多组学分析以及使用 ChIP-DNA和FAIRE-DNA进行的qPCR和Sanger测序分析表明,该SNP突变显著重塑了染色质结构和修饰状态,G等位基因比A等位基因具有更高的染色质活性。转录因子计算机预测发现该SNP位点区域是一个典型的FLI1转录因子结合位点,且对风险G等位基因有更高的选择性。我们使用GTEx数据库进行了 eQTL分析并在白血病细胞中进行了 CRISPRa和CRISPRi实验,确定CSGALNA CT1为rs1388941调控的靶基因。同时,在rs1388941基因组编辑的K-562单克隆细胞中,该位点区域的缺失会显著降低染色质的开放程度,大幅下调CSGALNACT1基因的表达水平,并能显著抑制细胞的增殖能力。进一步,我们还发现CSGALNACT1基因的过表达会增强转录因子STAT5的活性,并能上调CyclinD1基因的表达,促进细胞增殖。在本小节研究中,我们阐明了功能性SNP位点rs1388941的风险等位基因G通过增强转录因子FLI1的结合驱动下游基因CSGALNA CT1上调,促进细胞周期蛋白表达,加速细胞周期进程,进而介导8p21基因座白血病风险的一种可能的机制。3.基因调节性SNP rs6858698导致白血病风险的机制对于白血病风险相关SNP rs6858698,我们通过报告基因分析实验进一步确认风险等位基因C的增强子活性显著高于参考等位基因G。同时,ChIP-qPCR和FAIRE-qPCR分析与表观遗传组学数据都表明,rs6858698位于一个染色质开放活性增强子区域。进一步对Jurkat细胞ATAC-seq数据进行footprint分析并结合JASPR数据库预测,我们发现rs6858698位点参考等位基因G突变成风险等位基因C后形成了一个保守的E2F1结合基序,ChIP分析也表明E2F1能够与该位点区域结合。进一步,我们通过CRISPRa和CRISPRi实验分析确定CAMK2D为rs6858698位点调控的靶基因。并且,使用数据库TCGA和GTEx中的临床样本分析表明,白血病样本组织中CAMK2D表达水平明显高于正常组织。值得注意的是,在白血病患者中CAMK2D基因高表达与患者较低的总体生存率显著相关,提示CAMK2D与白血病的不良预后有关。进一步的报告基因分析实验表明,CAMK2D可能通过上调STAT5和NF-κB活性,影响下游Bcl-2、PIM-1、CAT、GLRX、c-FOS、c-Myc和c-IAP等众多靶基因的表达,参与细胞增殖、凋亡、分化和氧化应激等生理过程,从而促进白血病的发生发展。我们的结果系统地证明了 rs6858698位点风险等位基因C通过增强E2F1的结合,上调CAMK2D的表达,影响下游多条信号通路,增加疾病风险的机制。4.基于膜锚定亲和标签的基因转染阳性细胞分选系统对于获得的疾病相关基因进行体外致病功能研究时,基因递送效率成为白血病相关基因功能研究的重要限制因素。为了解决悬浮白血病细胞等难以转染细胞中的低转染效率制约基因功能研究的问题,我们开发了一种可以高效富集转染阳性细胞的亲和细胞分选系统。该系统使用带有亲和标签Twin-Strep-Tag(TST)的膜定位EGFP荧光蛋白作为质粒标记,在转染阳性细胞中可表达该荧光亲和分选标签并展示在细胞表面,基于亲和标签和配体之间的高亲合性,用配体偶联的磁珠即可实现转染阳性细胞的高效分离,并且分选标签中的荧光蛋白使阳性细胞易于通过荧光显微镜进行观察和通过流式细胞分析进行定量,便于评估分选前后样品中阳性细胞的比例。我们对比分析了 6种膜定位信号序列将分选标签靶向到细胞膜的能力,包括TST-EGFP-GPIBY55,TST-EGFP-GPIDAF,TST-EGFP-GPICEAM7 等三种糖基磷脂酰肌醇(GPI)变体和 TST-EGFP-TMITB3,TST-EGFP-TMITA5,TST-EGFP-TMITAV 等三种跨膜结构域(TMD)变体。激光扫描共聚焦显微镜观察分析表明,在Lenti-X 293T细胞中6种分选标签变体都能高水平的表达并展示到细胞膜上。并且,在K-562,Lenti-X293T和22Rv1三个细胞系中,均可以用Strep-Tatin偶联磁珠实现转染阳性细胞的高效分选和富集,其中,GPI膜锚定类型的分选标签表现出了优于TMD类型标签的性能,在K-562细胞中,亲和分选可以使阳性细胞比例从16%提高到95%,而根据EGFP RNA水平确定的富集倍数更是高达10倍以上。进一步,我们使用TST-EGFP-GPIBY55分选标签构建了基因过表达,shRNA基因敲低和CRISPR/Cas9基因组编辑实验的载体,分别转染K-562细胞,亲和分选之后测定目标基因的变化。结果显示,在基因过表达实验中,亲和分选富集的细胞中基因过表达倍数从10倍提高到了 58倍;在shRNA基因敲除实验中,分选富集的细胞中基因敲除效率从12%提高到53%;CRISPR/Cas9基因组编辑实验中分选富集的细胞表现出了更显著的基因编辑,indel百分比从20%增加到79%。总之,我们的新型转染阳性细胞亲和分选系统可极大提高转染阳性细胞的比例,有效的促进基因功能研究。研究结论本课题基于二代测序技术使用一种高效的并行报告基因分析系统,结合全基因组染色质活性分析高通量测序数据,分析鉴定出55个具有潜在基因调控活性的白血病风险相关SNP,并深入探究了 2个功能性风险位点rs1388941和rs6858698导致疾病易感性的机制。我们通过一系列分子、细胞水平的实验阐明了功能性白血病风险遗传变异的潜在生物学功能和机制。其中rs1388941风险等位基因G特异性结合转录因子FLI1,促进位点区域染色质开放,并上调CSGALNACT1基因表达,提高STAT5信号通路活性,促进下游CyclinD1基因的表达,影响细胞增殖,从而揭示了该位点在白血病发展中可能的致病机制。另外,rs6858698 SNP的参考等位基因G突变成风险等位基因C形成一个保守的E2F1结合基序,通过增强E2F1染色质结合驱动CAMK2D基因表达,上调STAT5和NF-κB信号通路活性,影响下游众多靶基因表达,参与细胞增殖、凋亡、细胞分化和氧化应激等生理过程,从而影响白血病的发生发展。我们的研究结果对于理解癌症遗传易感的机制具有重要的意义,为功能性白血病风险位点提供了细致的基因功能注释,为白血病的诊断和治疗提供潜在的生物标记物,也为其在临床治疗中的应用提供有力的证据支持。同时,为了克服悬浮白血病细胞转染效率低的问题,我们开发了基于膜锚定亲和分选标签的细胞分选系统来富集转染阳性细胞,可简单、高效地提高分选后细胞中的转染阳性细胞比例。为在白血病细胞系进行shRNA基因敲低以及CRISPR/Cas9基因组编辑分选细胞单克隆等实验高效地富集转染阳性细胞,促进了难转染细胞系中的基因功能研究。