胃癌是一种世界范围内常见的消化系统肿瘤,五年生存率为30-65%,严重危害人类健康。然而,尽管在过去几十年中,亚洲范围内胃癌患者的死亡率在全球范围内一直居高不下,仍还没有疗效较好且毒副作用较小的药物。华蟾素是中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍干燥表皮的水煎煮提取物,具有清热解毒、消肿止痛的功效。近年来,其抗胃癌作用引发人们关注,可通过不同的途径发挥抗胃癌活性,但仍不能完全解释华蟾素注射液抗癌的药物疗效与致死性脂质过氧化相关的铁死亡在癌症生物学中发挥的重要作用。因此,本研究从细胞铁死亡角度出发研究华蟾素注射液抑制胃癌细胞增殖,并进一步探讨其促进铁死亡发生可能的机制。目的:研究华蟾素注射液对胃PF-02341066癌的体内外抑制作用,并从细胞发生铁死亡脂质代谢途径为切入点,探讨华蟾素注射液抗胃癌的作用及其分子机制。方法:首先通过体内外实验观察,研究华蟾素注射液对胃癌的抑制作用,体内通过构建MGC-803裸鼠移植瘤观察移植瘤大小变化、移植瘤H&E染色和免疫组化结果,以探究华蟾素注射液对胃癌裸鼠的体内抑制作用;体外通过MTT法观察华蟾素注射液对不同胃癌细胞株的抑制增殖作用并筛选后续研究适宜浓infection of a synthetic vascular graft度,通过倒置显微镜观察胃癌细胞的形态变化。采用不同细胞死亡方式抑制剂作用细胞后初步确定华蟾素注射液是否会促进胃癌细胞铁死亡的发生,进一步通过透射电镜观察表征铁死亡发生的指标胃癌细胞线粒体变化;通过相应生化指标检测试剂盒检测氧化应激指标MDA、GSH、SOD水平变化;通过流式细胞仪分析脂质和胞质ROS水平变化以及采用紫外分光光度计检测铁离子含量变化;通过Western blot考察胃癌细胞以及瘤体中铁死亡特征蛋白如G更多PX4、COX2、FTH1以及与脂质代谢相关的蛋白如ACSL4、LPCAT3和ALOX15表达变化情况。为了进一步确定华蟾素注射液促进胃癌发生铁死亡是否是通过调控以ACSL4为中心的脂质代谢,通过药理抑制和基因沉默两种方式抑制了细胞ACSL4蛋白的表达后进行验证,检测了华蟾素注射液作用后细胞活性的变化以及与脂质代谢相关的蛋白变化。结果:1、华蟾素注射液可抑制胃癌细胞体内外的增殖华蟾素注射液能够抑制胃癌MKN-45、SGC-7901和MGC-803细胞的生长,其中对胃癌SGC-7901和MGC-803细胞的抑制作用较为显著,但对胃癌MKN-45细胞的敏感性较低。华蟾素注射液对于胃癌SGC-7901和MGC-803细胞的抑制作用呈时间-剂量依赖性,与对照组相比,华蟾素注射液给药组细胞贴壁性差,细胞皱缩以及折光率低,作用24 h的IC_(50)值分别为6.387±0.12 mg/m L和5.761±0.23mg/m L。与对照组相比,华蟾素注射液低、中、高剂量组均能够抑制胃癌MGC-803裸鼠皮下移植瘤质量和体积的生长(P<0.05或P<0.01),且能够缓解裸鼠因胃癌的存在而引起的体重下降,其中华蟾素注射液中、高剂量组抑瘤作用与阳性对照药5-Fu相当或更好;H&E染色观察发现,对照组裸鼠肿瘤细胞细胞核完整,细胞排列致密。华蟾素注射液各剂量组胃癌组织中胃癌细胞染色变浅,细胞之间出现明显裂隙,细胞核出现核固缩以及核碎裂的形态;免疫组织化学染色结果表明华蟾素注射液能够抑制胃癌瘤体中Ki-67蛋白的表达。2、华蟾素注射液可以诱导胃癌细胞发生铁死亡华蟾素注射液对胃癌SGC-7901和MGC-803细胞的抑制作用能够被自噬抑制剂CQ、凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、铁死亡抑制剂Ferrostin-1和铁螯合剂DFO部分抵消,其中铁死亡抑制剂Ferrostin-1和铁螯合剂DFO的抵消作用较为显著;透射电镜结果观察到胃癌SGC-7901和MGC-803细胞线粒体形态经华蟾素注射液作用后出现线粒体外膜破裂、体积变小、染色变深,而加入铁死亡抑制剂Ferrostin-1后线粒体体积又稍变大,染色变浅;与对照组细胞相比,胃癌SGC-7901和MGC-803细胞中MDA、铁、胞质和脂质ROS含量上升(P<0.05或P<0.01),而GSH、SOD含量下降(P<0.05或P<0.01)且这种作用均可被铁死亡抑制剂Ferrostin-1拮抗;免疫组化和Western blot结果发现,与对照组相比,华蟾素注射液低、中、高剂量组胃癌细胞以及瘤体中铁死亡特征性蛋白GPX4和FTH1表达下调,而COX2蛋白表达上调(P<0.05或P<0.01)。3、华蟾素注射液通过调控以ACSL4为主的脂质代谢诱导铁死亡免疫组化和Western blot结果发现,与对照组相比,华蟾素注射液低、中、高剂量组胃癌细胞以及瘤体中与铁死亡脂质代谢密切相关的蛋白ACSL4、LPCAT3和ALOX15蛋白表达均上调(P<0.05或P<0.01)。无MGC-803细胞毒性剂量的ACSL4药理抑制剂RSG与华蟾素注射液共同作用后,能够部分抵消华蟾素注射液对胃癌MGC-803细胞的抑制作用,这种作用与铁死亡抑制剂Ferrostin-1相当。Western blot结果发现经RSG处理后的MGC-803细胞中ACSL4蛋白表达下调且能够被华蟾素注射液部分拮抗(P<0.05或P<0.01)。Si-ACSL4成功将胃癌MGC-803细胞中ACSL4蛋白沉默,但经华蟾素注射液作用后又发现ACSL4蛋白的明显表达(P<0.05)。结论:1、华蟾素注射液可抑制胃癌细胞体内外增殖;2、华蟾素注射液通过诱导胃癌细胞铁死亡抑制胃癌体内外增殖;3、华蟾素注射液通过调节ACSL4介导的脂质代谢调控胃癌铁死亡。