第一部分:基于单细胞测序的卵巢NK细胞表型特征分析研究背景:卵巢是卵子发育、排卵以及性激素合成、分泌的主要场所,需要多种细胞协同作用保障其功能正常运行,局部免疫微环境对生理功能的维持发挥重要调控作用。越来越多的研究表明,组织器官局域免疫特性与外周免疫存在显著差异。组织器官含有独特的免疫细胞亚群和功能分子,形成独特的区域免疫特性,维持组织器官稳态。卵巢局部的高类固醇激素环境及卵母细胞与多种细胞间的相互作用可能赋予卵巢免疫细胞独特的表型与功能重塑。但目前卵巢局域免疫特性的相关研究仍是空白,我们对于卵巢中多种免疫细胞类型的功能探究还不充分,对于卵巢局域免疫微环境的构成及其在维持卵巢功能中的作用认识非常有限。作为第三大类淋巴细胞,自然杀伤细胞(natural killer cells,NK)不仅能够快速识别和杀伤靶细胞发挥直接的细胞毒效应,还能通过合成和分泌多种细胞因子影响其他免疫细胞的活性,从而发挥免疫调节功能。近年来在肝脏、脂肪、肾脏、唾液腺、子宫等相继发现了新的组织驻留NK细胞,它们在组织器官长期驻留,具有独特的表型功能特征,对所在组织器官特定生理功能的维持发挥重要作用。近些年来,NK细胞在女性生殖系统的研究主要集中在母胎界面蜕膜组织,目前关于卵巢NK细胞亚群异质性、表型特征和功能的研究仍非常有限。本研究第一部分对小鼠卵巢CD45+免疫细胞进行了单细胞转录组测序,分析和验证卵巢中多种免疫细胞的组成,并进一步聚焦卵巢NK细胞,对其亚群分类、表型特征和组织驻留性进行了深入解析。研究目的:通过单细胞转录组测序及流式细胞术分析,探究小鼠卵巢NK细胞亚群分布及基因表达谱,明确卵巢驻留NK细胞表型特征和组织驻留特性。研究方法:收集小鼠卵巢组织样本,通过流式细胞分选技术富集CD45+免疫细胞进行10x Genomics 3’端转录组测序。Seurat筛选高变基因进行降维聚类及差异基因表达分析,流式细胞分析技术在蛋白水平验证不同免疫细胞群表型特征,连体共生模型评估卵巢NK细胞不同亚群组织驻留特性。研究结果:(1)绘制小鼠卵巢免疫细胞图谱通过小鼠卵巢免疫细胞单细胞转录组测序,鉴定出多种卵巢免疫细胞类型,主要包括T细胞、单核-巨噬细胞、NK细胞、树突状细胞、粒细胞、肥大细胞、γδT细胞和2型固有淋巴细胞等。多数免疫细胞存在明显异质性,可根据特异性高表达基因进一步分成多个亚群。通过流式细胞术验证出驻留巨噬细胞、驻留NK细胞、γδT细胞和2型固有淋巴细胞等新细胞类型,提示卵巢免疫细胞具有高度异质性。(2)卵巢NK细胞亚群表型特征分析对卵巢NK细胞进行亚群分析,发现一群NK细胞高表达Itga1(CD49a),通过连体共生模型发现该CD49a+NK细胞具有卵巢驻留性。并且通过GO和KEGG富集分析、Monocle拟时序分析及流式细胞术蛋白水平验证,解析了卵巢驻留NK(trNK)细胞和循环NK(cNK)细胞的表达谱差异,证实卵巢CD49a+NK细胞具有组织驻留性和低细胞毒性、高免疫调节能力的独特表型特征。(3)卵巢NK细胞亚群动态变化探究对不同动情周期和不同年龄的小鼠卵巢NK细胞进行分析,发现驻留NK细胞比例在动情前期和动情期富集,动情后期和间期下降,可能与排卵后卵巢cNK募集增多有关。随着卵巢衰老,卵巢两NK细胞亚群均减少,驻留NK细胞减少幅度略低导致其在老龄小鼠卵巢比例偏高,提示卵巢NK细胞亚群随动情周期和年龄呈现不同规律性动态变化。研究结论:卵巢免疫细胞具有高度异质性,并且存在两个NK细胞亚群,其中CD49a+NK细胞具有组织驻留性和低细胞毒性、高免疫调节能力的独特表型特征,且随动情周期和年龄呈现规律性变化。第二部分:NK细胞在卵巢稳态维持及病理性衰老中的作用研究背景:在第一部分研究中,我们鉴定并验证了卵巢NK细胞的表型特征及驻留特性,发现卵巢中两个NK细胞亚群数量均随卵巢衰老而减少,提示NK细胞可能对卵巢稳态维持具有重要作用。近年来在肝脏、脂肪、肾脏、唾液腺、子宫等多个组织器官相继发现了新的组织特异性NK细胞,这些trNK细胞在不同组织器官的功能具有高度异质性,对维持所在组织器官的特定生理功能具有重要作用;此外,NK细胞又是一把双刃剑,其功能异常亦可导致该组织器官多种炎性疾病发生。例如,子宫蜕膜NK细胞比例可高达70%,在妊娠过程中参与蜕膜血管重塑、滋养细胞层入侵及母胎界面免疫耐受形成和维持;脂肪NK细胞可通过杀伤巨噬细胞来调控糖脂代谢和脂肪组织稳态,而在2型糖尿病中驻留NK却通过促进M1巨噬细胞极化参与胰岛素抵抗的形成。然而目前关于卵巢驻留NK细胞功能的相关研究仍是空白,卵巢NK细胞对卵巢免疫稳态的维持及在病理性卵巢衰老中的作用尚不清楚。因此,本部分将利用NK细胞体内清除及最常见的卵巢衰老性疾病—卵巢早衰模型构建等手段,进一步探究卵巢NK细胞在卵巢生理稳态维持及卵巢衰老中的作用和机制。研究目的:通过anti-NK1.1抗体清除NK细胞观察卵巢表型功能改变,明确NK细胞缺失对卵巢生理功能的影响;通过构建免疫性卵巢早衰(POI)模型联合NK细胞清除,明确NK细胞的应答情况及其在病理性卵巢衰老中的作用。研究方法:应用anti-NK1.1抗体清除NK细胞,观察卵巢大小、形态,血清激素水平,卵泡数等指标变化,结合转录组测序与流式细胞术检测卵巢微环境其他免疫细胞亚群改变;通过pZP3接种构建免疫性POI模型并联合清除NK细胞,观察卵巢炎相关表型变化,流式细胞术检测卵巢T细胞和NK细胞的应答情况。研究结果:(1)NK细胞清除导致卵巢衰老表型应用anti-NK 1.1单克隆抗体或同型对照抗体处理小鼠,发现NK细胞清除组小鼠动情周期紊乱,血清雌二醇明显降低,卵巢各级卵泡减少,颗粒细胞凋亡显著增多;结合测序数据与流式细胞术检测发现NK细胞清除组卵巢巨噬细胞浸润增加且向M1型极化增多,提示卵巢NK细胞缺失通过增加M1巨噬细胞极化而导致POI发生。(2)免疫性POI模型中NK细胞发生明显应答并抑制T细胞活化通过pZP3接种建立免疫性POI小鼠模型,发现造模组小鼠动情周期紊乱,血清卵泡刺激素升高,卵巢各级卵泡减少,呈POI表型,提示造模成功;模型组卵巢T细胞PD-1表达升高,同时卵巢PD-L1+NK细胞数量增多、CD25表达增高。应用体内清除抗体进行NK细胞清除可进一步加重POI表型,提示NK细胞在免疫性POI发生免疫应答,通过PD-L1-PD-1信号轴抑制炎性T细胞过度反应。研究结论:NK细胞缺失不仅导致卵巢衰老,而且可加重免疫性POI表型,提示NK细胞在卵巢稳态维持中发挥保护作用,且该保护作用可能是通过NK细胞对卵巢巨噬细胞或T细胞发挥负调控效应来实现的。第三部分:早发性卵巢功能不全患者NK细胞表型功能异常研究背景:在第二部分研究中,我们发现NK细胞体内清除可导致卵巢衰老,且会加重小鼠免疫性POI的表型,提示NK细胞缺失与卵巢衰老发生相关。早发性卵巢功能不全(POI)是最常见的女性生殖衰老性疾病之一,其主要特征为女性在40岁之前卵巢功能提前衰竭。POI病因复杂,约5-30%可以归因于自身免疫异常。自身抗体异常、细胞免疫失衡和自身免疫性疾病等均可导致卵巢成为免疫系统攻击的靶标,参与POI的发生发展,但卵巢局部存在何种异常免疫应答尚不十分清楚。目前,关于NK细胞异常与POI的研究较少,且研究主要以外周血变化为主,曾报道POI患者外周循环NK细胞数量减少。关于人卵巢局部NK细胞的表型特征及其异常是否与POI相关仍不清楚。新近对人卵巢单细胞转录组测序研究发现NK细胞是占比较高的免疫细胞之一,但未对其亚群组成和表型特征进行深入分析。因此,本部分研究将进一步明确人卵巢中NK细胞的亚群组成及表型特征,并初步探讨POI患者卵巢局部NK细胞表型与功能特性异常。研究目的:解析人卵巢中NK细胞的亚群组成及表型特征,探讨POI患者NK细胞表型与功能分子异常。研究方法:收集AG-221说明书人的外周血、卵巢组织和卵泡液,流式细胞术检测并比较不同样本中NK细胞的分群和表型特征;收集POI患者和正常卵巢储备对照女性的卵泡液,流式细胞术分析并比较NK细胞表型及功能性分子的表达差异。研究结果:(1)人卵巢中存在CD56bclinical oncologyrightCD16-/dim CD49a+驻留NK细胞通过对外周血、卵巢组织和卵泡液中的NK细胞亚群和表型分析发现,人卵巢局部CD56brightCD16-亚群比例高于外周血,存在CD56brightCD16-/dimCD49a+NK驻留NK细胞,该群细胞表达CXCR6、CD69和CD103等组织驻留相关标志物,且相较于CD56dimCD16+NK显著低表达细胞粘附分子CD11b、CD62L和转录因子T-bet,高表达抑制性受体NKG2A,以上表型与小鼠CD49a+卵巢驻留NK细胞表达一致,提示人卵巢中也存在驻留NK细胞且表型特征与小鼠相似。(2)POI患者中NK细胞表型功能异常对POI患者和正常卵巢储备对照女性卵泡寻找更多液NK细胞亚群表型分析,发现POI患者卵巢CD56brightCD16-/dim NK细胞表达杀伤因子颗粒酶B明显降低、CD56dimCD16+NK细胞表达分化标志物CD57显著增高,提示POI患者卵巢NK细胞不同亚群均出现表型功能异常。研究结论:人卵巢也存在驻留NK细胞,且表型特征和小鼠相似。POI患者卵巢NK细胞不同亚群均出现表型功能异常。