嗜冷菌能够在低温下生长繁殖并产生耐热胞外水解酶,是污染原料乳的主要微生物。嗜冷菌产生的胞外蛋白酶及脂肪酶经过超高温瞬时灭菌(UHT)处理仍无法完全灭活。残留的酶活尽管很难被准确检测出来,但是仍可导致UHT乳在货架期内发生品质劣变,因而嗜冷菌及其产生的酶类对长货架期的乳制品具有较大的潜在危害性。原料乳中嗜冷菌的主要污染来源目前没有定论。理论上,嗜冷菌在牧场环境、采奶器械、储藏运输、生产加工等环节均有污染原料乳的可能,而且嗜冷菌种类多样,互作效应复杂,产酶特性也有所不同,这为科学防控嗜冷菌污染及耐热酶的危害带来了挑战。为了探明原料乳中嗜冷菌的污染来源,明确嗜冷菌的产酶特性,本研究采集了河北和广东牧场的春夏秋冬四个季节的生乳和环境样本。通过传统培养的方式对嗜冷菌进行分离鉴定,探究原料乳中嗜冷菌污染来源及其产酶的特性。同时,利用宏基因组技术进一步对河北秋季牧场原料乳中嗜冷菌及其胞外蛋白酶(EC 3.4.24.40)和脂肪酶(EC3.1.1.3)进行了深入挖掘,最后研究了原料乳中典型嗜冷菌胞外耐热酶类对UHT乳货架期的影响。具体的研究结果如下:(1)通过传统培养方式探究原料乳中嗜冷菌污染。共分离出嗜冷菌338株,共38个属。丰度最高的三个属是假单胞菌属(Pseudomonas,66.47%),不动杆菌属(Acinetobacter,9.67%)和冷杆菌属(Psychrobacter,8.76%)。牛舍垫土中的嗜冷菌丰度和种类最高,其次为前三把奶,可能是原料乳中的重要污染来源。而牧场储奶罐和运奶车的奶罐也容易受到嗜冷菌污染。青储饲料和饮用水中嗜冷菌含量较少。原料奶中假单胞菌属是主要的嗜冷菌,其中产氮假单胞菌(P.azotoformans,29.09%)占比最高。在地理和季节上,广东牧场的污染概率大于河北。嗜冷菌的污染分布与温度或季节存在密切联系。(2)基于宏基因组技术对河北此网站秋季牧场中原料乳的微生物及嗜冷菌群落组成和产胞外蛋白酶(EC 3.4.24.40)和脂肪酶(EC 3.1.1.3)的基因丰度进行分析。该牧场原料乳中耐热酶的污染主要来自嗜冷菌,为假单胞菌属和不动杆菌属。牛舍垫土通过污染奶牛乳头,在挤奶环节进入原料乳收集管路而造成污染。储奶罐的耐热酶来源还可能来自储奶罐本身Sensors and biosensors以及温度控制不当所致。(3)进一步对原料乳中嗜冷菌产胞外蛋白酶及脂肪酶的特性进行分析。分别具有54.41%和33.08%的嗜冷菌具有蛋白和脂解能力,主要来自假单胞菌属(Pseudomonas,65.44%),以产氮假单胞菌(P.azotoformans,31.46%)为主,其次分别为不动杆菌属(Acinetobacter,11.76%)及微杆菌属(Exiguobacterium,5.88%)。假单胞菌属及不动杆菌属的产酶能力最强。P.fluorescens、P.azotoformans和P.paralactis不仅是优势菌,而且具有较高的蛋白水解和脂解活性。(4)对原料乳中一株典型嗜冷菌-P.azotoformans B15-1的产胞外蛋白酶和脂肪酶规律及其耐热性进行探究。28℃下,蛋白酶和脂肪酶最高达到160 U/m L,1.15 U/m L。在135℃、5、10和15 s条件下的蛋白水解和脂解活性均无显著变化(P<0.05),其平均残留率分别为3.08%、19.16%。(5)添加了极低量的典型嗜冷菌胞外蛋白酶和脂肪酶到UHT乳,对其品质变化规律进行研究。SDS-PAGE显示,UHT乳中主要被水解的是酪蛋白,首先是κ-CN,其次为β-CN及α-CN,对β-LG和α-LA几乎没有水解。随着时间的增加,UHT乳的蛋白水点击此处解度、酸度和粒径增大,FFA及FAA的浓度增加。37℃下加速了UHT乳的品质劣变,其次是25℃。(6)建立了化学动力学模型和BP神经网络对25℃-高酶活量UHT乳(蛋白酶活性:1.0 U/m L,脂肪酶活性:0.06 U/m L)的货架期进行验证。以蛋白水解度为限制指标建立化学动力学模型,得出化学动力学模型为:t=ln(A/A_0)×e–6427.3/T-17.1,验证UHT乳货架期的标准偏差为4.47%。BP神经网络验证货架期的标准误差为0.42%。因此,利用BP神经网络验证UHT乳的货架期结果更可靠。