目的本研究通过建立缺氧/复氧(H/R)细胞模型,旨在探索原肌球蛋白受体激酶A(Tropomyosin receptor kinase A,TRKA)对缺氧/复氧(Hypoxia/reoxygena tion,H/R)后心肌细胞H9c2的保护作用及其与PI3K/Akt/m TOR信号通路的关系。方法1、体外培养H9c2大鼠心肌细胞,不同浓度TRKA抑制剂GW441756(0、0.5、1、2、4、8、16和32μM)和PI3K抑制剂渥曼青霉素(0、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200和400n M)作用于H9c2细胞24h,应用CCKauto immune disorder-8法检测细胞增殖活性,筛选适宜的GW441756和渥曼青霉素浓度进行后续实验。2、建立体外缺氧/复氧细胞模型,实验分组:对照组(control)、模型组(H/R)、TRKA抑制剂组(H/R+GW441756)、PI3K抑制剂组(H/R+渥曼青霉素)和联合用药组(H/R+GW441756+渥曼青霉素)。应用CCK-8法检测TRKA抑制剂和PI3K抑制剂对H/R后H9c2细胞增殖活力的影响。3、检测各组细胞乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)含量。采用DCFHDA染色后,荧光显微镜下观察荧光强度,使用Image J软件分析细胞内活性氧(ROS)含量,以探究TRKA抑制剂和PI3K抑制剂对H/R后心肌细胞氧化应激的影响。4、采用JC-1线粒体膜电位(MMP)试剂盒、Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒以及Western selleckchem Ferrostatin-1blot法探究TRKA抑制剂和PI3K抑制剂对H/R后心肌细胞凋亡的影响。5、探究使用TRKA抑制剂后,PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达情况:采用Western blot法检测GW441756和渥曼青霉素处理后各组细胞内p-TRKA(Tyr490)、TRKA、p-p85 PI3K、PI3K、p-Akt(Ser473)、Akt、p-m TOR(Ser2448)和m TOR的蛋白表达情况。结果1、常氧状态下,0-4μM浓度范围的GW441756和0-50n M浓度范围的渥曼青霉素分别处理24h后,细胞的增殖活性未发生显著变化,差异无统计学意义。8-32μM浓度范围的GW441756和100-400n M的渥曼青霉素可降低细胞增殖活性(P<0.05)。故选择4μM的GW441756和50n M的渥曼青霉素作用H9c2细胞24h作为后续实验条件。2、抑制TRKA和PI3K通路可抑制H/R后H9c2心肌细胞增殖活性:与H/R组相比,GW441756组和渥曼青霉素组细胞增殖活性下降(P<0.05);且与单独使用两种抑制剂组相比,联合使用两种抑制剂后对细胞增殖活性的抑制作用更强。3、抑制TRKA和PI3K通路可增加H/R后心肌细胞内氧化应激水平:与H/R组比较,GW441756组和渥曼青霉素组的LDH、MDA和ROS含量增加(P<0.05);且与两种抑制剂单独使用相比,联合使用两种抑制剂组细胞内LDH、MDA和ROS含量增加(P<0.05)。4、抑制TRKA和PI3K通路可增加H/R后心肌细胞内的凋亡水平:与H/R组相比,GW441756和渥曼青霉素组MMP显著下降(P<0.05);流式细胞检测细胞凋亡率增加(P<0.05);同时上调促凋亡蛋白Bax、caspase-3和下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(P<0.05)。且与两种抑制剂单独使用相比,联合使用组凋亡率增加(P<0.05)。5、抑制TRKA通路可减少H/R后H9c2心肌细胞内PI3K/Akt/m TOR信号通路相关蛋白的表达:与H/R组比较,GW441756处理后,p-PI3K、p-Akt、pTRKA和p-m TOR表达减少Colforsin(P<0.05)。与H/R组比较,渥曼青霉素处理后,p-PI3K、p-Akt和p-m TOR表达减少(P<0.05)。与两种抑制剂单独使用相比,联合使用组p-TRKA、p-PI3K、p-Akt和p-m TOR表达增加(P<0.05)。提示PI3K/Akt/m TOR信号通路的激活可能是TRKA对H/R后心肌细胞发挥保护作用的机制之一。结论1、TRKA和PI3K/Akt信号通路可通过降低缺氧/复氧后心肌细胞内氧化应激和细胞凋亡,发挥心肌保护作用。2、TRKA对缺氧/复氧后心肌细胞的保护作用,部分机制与激活PI3K/Akt/m TOR信号通路有关。