双酚A(Bisphenol A,BPA)是一种常见的内分泌干扰物,广泛应用于聚碳酸酯、环氧树脂、热敏纸以及食品容器等多种材料的制造。近年来BPA制品的市场需求和产量激增,加剧了人和动物的暴露风险。已被证实,BPA暴露会导致机体内NO蓄积,干扰信号通路的调节,引起组织损伤。硒(Selenium,Se)是维持生物体正常生理功能的必需微量元素之一。硒缺乏同样诱导NO过量产生,干扰免疫系统的功能,引起细胞死亡和组织损伤。由于硒在地球表面土壤中的不均匀分布,硒缺乏和BPA暴露同时出现成为常态。BPA暴露、硒缺乏联合发生会加重对组织的损伤及其损伤机制等相关研究未见报道。基于此,本课题提出了BPA暴露、硒缺乏通过iNOS/TNF-α轴诱导鸡脾脏组织发生细胞凋亡和程序性坏死,引起鸡脾脏组织损伤,并且BPA暴露和硒缺乏联合会加重这一过程的假设。本实验分别建立了BPA暴露和硒缺乏的肉鸡体内模型和MSB-1细胞体外模型。体内试验分为四组,对照组(NC组)、BPA暴露组(BPA组)、硒缺乏组(-Se组)、硒缺乏+BPA暴露组(-Se+BPA组)。体外试验分为五组,对照组(NC组)、BPA暴露组(selleck激酶抑制剂BPA组)、硒缺乏组(-Se组)、硒缺乏+BPA暴露组(-Se+BPA组)和硒缺乏+BPA暴露+TNF-α抑制剂QNZ(QNZ组)。应用H&E染色、透射电镜、荧光显微镜、TUNEL法、流式细胞术、AO/EB染色、免疫印迹法和q RT-PCR技术等检测了脾脏组织细胞形态学变化、细胞凋亡和细胞坏死、iNOS/TNF-α通路、线粒体凋亡相关通路和程序性坏死相关通路等,还检测了NO的含量和iNOS的活性。结果发现:(1)成功构建硒缺乏、BPA暴露和硒缺乏+BPA暴露组作用模型。病理组织学结果显示,BPA组脾脏组织白髓面积减小,红髓面积增加,中央动脉管壁增厚。-Se组脾脏组织红髓与白髓边界较模糊,白髓面积减小,红髓面积增加;淋巴细胞数量减少,细胞排列稀疏;红髓间红细胞数量增加,中央动脉管壁增厚。-Se+BPA组脾脏组织红髓与白髓边界模糊,白髓面积减小;淋巴细胞数量减少,细胞排列稀疏;红髓充血,中央动脉管壁增厚;还观察到细胞溶解、破碎的现象。透射电镜结果显示BPA组中淋巴细胞细胞核固缩,核周隙扩大,染色质边聚;线粒体嵴断裂、肿胀;细胞膜破裂。-Se组中淋巴细胞变形,细胞核固缩,核周隙扩大,染色质凝集;线粒体嵴断裂、肿胀和细胞膜碎裂。-Se+BPA组淋巴细胞明显变形,细胞核固缩,核周隙扩大,染色质凝集、边聚更为显著;线粒体嵴断裂、肿胀、空泡化;细胞皱缩,细胞膜溶解、破裂。上述结果提示BPA暴露和硒缺乏诱导鸡脾脏组织损伤,且联合处理损伤更为严重。(2)NO的含量和iNOS的活性检测结Fetal Immune Cells果表明,体内外实验组中NO的含量和iNOS的活性显著高于对照组,并且-Se+BPA组NO的含量和iNOS的活性显著高于BPA组和-Se组;体外实验中添加QNZ后抑制了-Se+BPA组中NO的含量和iNOS的活性(p<0.05)。上述结果证实BPA暴露和硒缺乏会引起鸡脾脏组织NO含量和iNOS活性增加,联合组比单独处理组作用更显著。(3)TNF-α通路检测结果显示,BPA组、-Se组和-Se+BPA组中iNOS、TNF-α、TNFR1和FADD的表达量明显升高;且-Se+BPA组中iNOS、TNF-α、TNFR1和FADD的表达量高于BPA组和-Se组;在体外试验中,添获悉更多加了QNZ后,抑制了-Se+BPA组中iNOS、TNF-α、TNFR1和FADD的表达水平(p<0.05)。以上结果证明BPA暴露和硒缺乏促进TNF-α通路激活,且联合作用促进了TNF-α通路的激活。(4)TUNEL、AO&EB染色和流式细胞术结果显示体内外实验组凋亡细胞和坏死细胞水平均显著高于对照组,并且-Se+BPA组细胞凋亡和细胞坏死水平显著高于BPA组和-Se组;体外试验添加QNZ后缓解了-Se+BPA组细胞凋亡和细胞坏死的发生(p<0.05)。q RT-PCR和免疫印迹结果显示,体内外实验组中细胞凋亡相关因子Bax、Caspase9、Caspase3和Cyt C以及程序性坏死相关细胞因子RIPK1、RIPK3和MLKL的表达增加,Bcl2的表达水平降低;且-Se+BPA组中细胞凋亡相关因子Bax、Caspase9、Caspase3和Cyt C以及程序性坏死相关细胞因子RIPK1、RIPK3和MLKL的表达较BPA组和-Se组明显升高,且Bcl2的表达明显降低;体外实验中添加QNZ抑制了Bax、Caspase9、Caspase3、Cyt C、RIPK1、RIPK3和MLKL的表达,并且上调了Bcl2的表达(p<0.05)。上述结果表明,BPA暴露和硒缺乏促进鸡脾脏组织细胞凋亡和程序性坏死的发生,并且BPA暴露和硒缺乏联合处理加重了这一促进作用。(5)热休克蛋白的检测结果显示,体内外实验组中HSP60、HSP70和HSP90的表达水平较对照组显著升高;且-Se+BPA组中HSP60、HSP70和HSP90的表达水平显著高于BPA组和-Se组;体外试验中观察到QNZ抑制了Se+BPA组中HSP60、HSP70和HSP90的表达水平(p<0.05)。上述结果说明,热休克蛋白参与调节BPA暴露和硒缺乏诱导鸡脾脏组织发生细胞凋亡和程序性坏死。综上所述,BPA暴露和硒缺乏激活iNOS/TNF-α信号通路诱导鸡脾脏组织细胞凋亡和程序性坏死。本研究丰富了BPA的毒理学和硒缺乏的免疫毒性机理,为防治禽类BPA暴露和硒缺乏症提供理论依据,也为比较医学提供借鉴。