减肥保健食品因具有降脂、减重等功能在肥胖或控脂人群中颇受欢迎。减肥保健食品的效果见效缓慢,通过在保健品中非法添加化学药物后,减肥效果显著,但是长期使用时会对人体造成一定程度的伤害,如电解质紊乱、心脑血管疾病以及肝肾功能损伤等,严重时可导致死亡。呋塞米(Furoesmide,LASIX)是一种利尿剂,它的作用机制是改变人体内相关酶活或细胞膜的通透性,来加速或抑制细胞的一些代谢,从而加速体内水分排出,造成体重暂时减轻的现象。该药物常被违法添加于减肥保健品中,导致引发一系列的副作用,包括呕吐、头晕、引发肾功能损伤和低钾血症等。目前呋塞米残留量的检测方法主要是仪器分析的方法,该方法前处理复杂、耗时长、成本投入高,无法实现现场快速筛查检测。近年来,免疫层析分析方法(Lateral flow immunoassay,LFIA)由于具有操作简单、低成本等优点,已被广泛应用于细菌、病毒、蛋白质和小分子等的检测。因此,制备亲和力以及灵敏度高的抗LASIX单克隆抗体,并将其运用于免疫层析试纸条,对于实现LASIX违禁使用的现场快速筛查检测具有重要的意义。聚集诱导发光染料(Aggregation-induced emission luminogens,AIEgens)具有聚集发光特性,通过负载聚集诱导发光染料制备获得的荧光微球(Aggregation-induced emission fluorescent microspheres,AIEFMs),可以通过增加染料的负载量实现荧光微球发光强度的最大化,并有效地解决了常规有机发光染料聚集引发猝灭(Aggregation-causedquenching,ACQ)的问题。同时,AIEFMs具有耐光漂白、发光强度高、稳定性好以及斯托克斯位移大等优点,在生物成像、生物传感和食品安全等领域获得了研究者们的广泛关注。本研究采用活泼酯化法合成了呋塞米免疫原(LASIX-KLH),经对Balb/c小鼠进行一系列免疫,酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)评价小鼠的抗血清效价,再经过细胞融合后,成功获得了2株抗LASIX单克隆抗体。随后将AIEFMs与性能最佳的抗LASIX单克隆抗体偶联,实现了LASIX的高灵敏、快速检测,并证明了基于AIEFMs的免疫层析分析方法(AIEFMs-LFIA)在检测减肥保健品样本中LASIX的适用性和可行性。首先,采用EDC/NHS活泼酯化法将LASIX小分子与KLH蛋白偶联制备获得LASIX-KLH,经过免疫、血清测定、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选及细胞亚克隆等一系列过程,成功获得了2株抗LASIX单克隆抗体,分别命名为3H8和6D1单克隆抗体,以上两株单克隆抗体亚型均为IgG_1,效价分别为1:243000、1:81000,抗体亲和力别为3.48×10~9L/mol、3.63×10~8L/mol。在此基础上,通过ELISA评价selleckchem BI 10773了3H8单克隆抗体检测LASIX的性能,该抗体检测LASIX的50%竞争抑制浓度(IC_(50))为2.71 ng/m L,定量检测LASIX范围为0.39～18.82 ng/m L,最低检出限(LOD)为0.204 ng/m L;特异性实验结果表明,3H8单克隆抗体与LASIX结构类似物托拉塞米标准品(TOR)、氯噻嗪标准品(THI)、汴氯噻嗪标准品(BEN)、氢氯噻嗪标准品(HYD)和氯噻酮标准品(TRA)交叉反应率小于0.5%。其次,以红色超亮的AIEFMs为LFIA的信号探针,建立了AIEFMs-LFIA对于减肥保健食品中LASIX的高灵敏检测方法。在最优条件下,AIEFMs-LFIA检测LASIX的灵敏度为0.31 ng/m L,定量检测LASIX的线性范围为0.08～1.22ng/m L,最低检出限为0.049 ng/m L。采用AIEFMs-LFIA检测LASIX加标的减肥茶样品,批内、批间测试的加标回收率介于88.71%～111.78%,变异系数为3.7Plant symbioses4%～13.08%,表明AIEFMs-LFIA定量检测实际减肥茶样本中LASIX具有较好的精密度和准确性。此外也验证了AIEFMs-LFIA与LASIX结构类似物无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。ZD1839纯度随后将AIEFMs-LFIA应用于18个人工污染LASIX的减肥茶和减肥胶囊样品,结果表明AIEFMs-LFIA检测结果与ELISA试剂盒具有良好的一致性。总之,本研究建立的AIEFMs-LFIA适用于减肥产品中LASIX的高灵敏、快速检测。