猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PRo V)和猪德尔塔冠状病毒(PDCo V)均可引起猪只腹泻。哺乳仔猪在感染后出现严重腹泻和剧烈呕吐,且病死率非常高。猪病毒性腹泻病所表现的症状极为相似,在临床上难以进行区分,而猪腹泻病毒混合感染的情况也较为常见。因此,本研究建立了四种猪腹泻病毒多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,用于临床鉴别诊断。目前,在规模化猪场的腹泻病毒检测工作中,常用磁珠法(自动化)提取大量腹泻样本的核酸。但是,受到多种因素的影响,存在部分样本核酸提取失败的情况,从而造成抗原检测结果的假阴性。因此,本研究中还建立了猪源基因TaqMan荧光定量PCR检测方法,用于监测核酸提取的质量。另外,该方法还具有多种延伸应用:猪源性MS-275配制成分的检测;作为猪源样品检测中的内参;用于实验室污染监测。主要研究的内容及结果如下:(1)四种猪腹泻病毒多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立以PEDV N、TGEV N、PRo V NSP3和PDCo V N基因的保守序列,设计四套特异性引物与探针。通过反应条件的优化,建立了四重荧光定量PCR检测方法。在敏感性方面,用已知病毒量(TCID_(50)/m L)的疫苗核酸为模板进行扩增,结果显示,最低能检测到的病毒量分别为PEDV 10~(-1)TCID_(50)/m L、TGEV 10~(-1)TCID_(50)/m L、PDCo V 10~(-2)TCID_(50)/m L、PRo V 10~(-1)TCID_(50)/m L,说明该方法的敏感性较好。在特异性方面,仅阳性混合模板的反应出现特异性扩增曲线,说明其具有良好的特异性。重复性试验的结果显示,变异系数均在3%以下,说明该方法具有较好的稳定性。(2)四种猪腹泻病毒多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的应用应用建立的方法检测了182份腹泻样本,其中有31份PEDV阳性,1份PDCo V阳性,TGEV和PRo V均为阴性。自建方法与商品化试剂盒的的阳性符合率为90%,且自建方法在敏感性和准确性方面均优于所购的商品化试剂盒。(3)猪源基因TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立根据猪源细胞(PK-15Avian infectious laryngotracheitis)的线粒体细胞色素B(cytb)基因设计引物和探针,通过优化反应体系和反应条件,建立了猪源基因TaqMan荧光定量PCR检测方法。在敏感性试验中,用已知细胞数的PK-15细胞的DNA为模板进行扩增,结果显示,最少能检测到的猪源细胞数为70个/m L,说明该方法具有较好的敏感性。在特异性试验中,仅猪源细胞DNA的反应出现特异性扩增曲线,说明其特异性良好。在重复性试验中,变异系数均在1%以下,说明所建立的方法具有良好的重复性。(4)猪源基因TaqMan荧光定量PCR检测方法的应用应用猪源基因荧光定量PCR检测方法,对182份核酸(腹泻样本)进行提取质量的监测。结selleck合成果显示,169份核酸样品呈猪源基因阳性,13份呈阴性,而其对应的腹泻病毒检测结果同为阴性,重新采样并提取核酸后再次检测猪腹泻病毒。复检结果表明,首次检测的部分结果并不准确,而实际存在腹泻病毒的感染。在猪源性成分检测中,抽检了50份饲料和饲料原料,检测结果均为猪源基因阴性。