背景癫痫是全球范围内最常见的神经系统疾病之一,在世界范围其患者总数约有5000万。卡马西平(Carbamazepine,CBZ)是一种三环类化合物,作为传统抗癫痫药物,用于治疗癫痫和其他神经与精神疾病。CBZ可经由细胞色素P450Tofacitinib说明书(cytochrome P450,CYP)酶系代谢从而发生羟化反应,但其代谢激活基础上可是否具有致突变作用尚不清楚。目的探究CBZ对哺乳动物细胞的基于代谢激活的致突变作用(基因和染色体改变)、所涉人类CYP酶以及其染色体损伤类型。方法首先采用计算机模拟分子对接技术分析CBZ与人类CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP2B6、CYP2E1和CYP3A4酶(外源化学物代谢活化所涉主要的CYP酶亚型)活性中心结合的自由能及构象(底物潜能),并在此基础上设计表达不同CYP酶的重组细胞系的实验。采用重组表达人类上述CYP酶的中国仓鼠肺成纤维(V79)细胞系(由本身不具有CYP酶、磺基转移酶(SULT)及葡萄糖醛酸基转移酶(UGT)活性的母细胞系V79-Mz经基因工程构建而得)、人类肝癌(HepG2)细胞系(CYP酶表达量低,但可诱导)以及由HepG2细胞衍生、内源性表达人多种CYP酶相对丰富的C3A细胞系,通过CCK-8实验检测细胞活力的变化,微核试验检测CBZ染色体损伤效应;在此基础上采用抗着丝粒蛋白(centromere protein,CENP)B免疫荧光法分析微核所含着丝粒;并进一步采用免疫印LY2157299体内实验剂量迹实验(Western Blot)分析受试细胞γ-H2AX含量(该蛋白增高反映DNA双链断裂);最后通过PIG-A实验分析受试物诱发基因突变的效应。结果(1)分子对接结果显示 CBZ 与人 CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP2B6、CYP2E1、CYP3A4酶活性中心结合能均为负值,但仅与CYP2B6、CYP2E1亚铁血红素中铁离子的距离小于6.0 (?)(而在其他CYP酶该距离介于8.0(?)至10.1(?)之间),提示人类CYP2B6、CYP2E1相较于其他CYP酶更有可能催化CBZ发生生物化学反应。(2)采用表达上述CYP酶的重组V79细胞进行微核实验,CBZ(暴露时间24 h,即2个细胞周期)对表达CYP2B6的V79重组细胞在10 μM及以上浓度诱发微核形成,而对V79-Mz和表达CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP2E1以及CYP3A4的V79重组细胞则无效应或仅有微弱效应。根据该结果进一步采用表达人CYP酶相对丰富的C3A细胞进行微核实验,CBZ(暴露时间72h)可显著诱发微核形成(阈浓度10 μM),且该效应可被1-氨基苯三唑(ABT,一种广谱CYP酶抑制剂)和噻氯匹定(Ticlopidine,CYP2B6特异性抑制剂)所阻断。此外,对于经CShort-term antibioticICTO(10 μM,组成型雄甾烷受体(CAR)激活剂)预处理18 h的HepG2细胞,CBZ(暴露时间48 h)亦诱发微核形成(阈浓度10 μM)。而对于经RIF(10μM,孕烷X受体(PXR)激活剂)预处理的HepG2细胞,CBZ(暴露时间48 h)仅在最高受试浓度(40 μM)使微核细胞率增高;对于经PCB126(0.04μM,芳烃受体(AhR)激活剂)预处理的HepG2细胞,CBZ(暴露时间48 h)则不呈现诱发微核效应。(3)采用着丝粒蛋白B(CENP-B)免疫荧光法对微核的着丝粒组分进行显色,结果是CBZ对C3A细胞选择性诱发着丝粒阴性的微核形成,其阈浓度亦为10 μM,且具有浓度依赖性;并且,CBZ对C3A细胞诱导γ-H2AX蛋白水平升高,而HepG2细胞中γ-H2AX水平不受影响,提示CBZ所致DNA损伤为典型的致断裂作用。PIG-A致突变实验显示CBZ诱发C3A细胞PIG-A基因突变(阈浓度5 μM),效应呈浓度依赖性;而在HepG2细胞的结果为阴性,提示CBZ在代谢活化基础上可诱发基因突变。结论CBZ可经CYP2B6代谢活化而获得遗传毒性,它可在相当于人体内暴露浓度范围对哺乳类(包括人类)细胞发挥致断裂与诱发基因突变作用。