作为一种重要的非天然氨基酸,L-叔亮氨酸广泛应用于抗癌、抗艾滋病药物以及生物抑制剂等相关领域。亮氨酸脱氢酶(Leu DH)属于NADH依赖型酶,对三甲基丙酮酸有着良好的催化活性,可以用来高效合成L-叔亮氨酸。利用Leu DH催化制备L-叔亮氨酸具有反应条件温和、产物光学纯度高等优点,已成为生产L-叔亮氨酸重要方法之一。本研究通过基因挖掘及半理性设计和迭代突变等技术,获得具有高催化效率的亮氨酸脱氢酶。具体内容如下:(1)进行了酶基因挖掘、克隆表达和酶学性质分析。选用已报道的酶活最佳的Leu DH序列作为探针,在NCBI数据库里进行序列比对,从中筛选了5个亮氨酸脱氢酶基因,并进行了克隆和表达。其中来源于Exiguobacterium sibiricum的EsiLeuDH(WT)的酶活最高,粗酶液的比酶活达到15.6 U·mg~(-1),纯化后比酶活达到34.3 U·mg~(-1)。酶学性质研究表明EsiLeuDH的最适p H为9.5、最适温度为30℃;EsiLeuDH对大部分脂肪族酮酸均具有较高酶活力,与其他报道的亮氨酸脱氢酶的底物特异性一致,但对于长链酮类物质均未检测到酶活性。(2)基于半理性设计预测了潜在突变位点,利用丙氨酸扫描和迭代突变技术对EsiLeuDH进行了分子改造。利用同源建模构建其三维模型,并与底物三甲基丙酮酸进行了分子对接;同时,通过氨基酸保守性分析及同源蛋白序列对比确定了17个潜在突变位点,均为非保守位点。通过丙氨酸扫描medical acupuncture技术筛选到4个正向突变株E123A、V125A、T143A和V300A,其纯化后的比酶活相比于野生型(WT)分别提高了44%、36%、35%和17%。对4个正向突变位点进行定点饱和突变,获得了5株正向突变株E123V、E123S、V125M、T143C和T143M,其中最优突变株E123V,比酶活相比于WT提高了87%。进一步采用迭代饱和突变策略对三个正向突变位点进行组合突变,获得最优组合突变株EsiLeuDH-M3(E123V/V123M/T143C),比酶活相比于WT提高了306%。(3)进行了突变体结构与活性关系的分析。通过比较改造前后的蛋白结构,发现突变体EsiLeuDH-M3的底物结合口袋明显扩大,使得底物进入活性中心的空间位阻减小,提高了蛋白对于底物的接受程度,进而提高了酶的活性。对WT和突变体进行分子动力学模拟,结果表明突SB431542变体的氨基酸残基的波动更小,结构更加稳定,且更有利于与底物结合进行催化反应。(4)对WT和组合突变体EsiLeuDH-M3进行了酶学性质的比较和分析。WT和突变体EsiLeuDH-M3的最适反应条件为30℃,p H 9.5;突变体EsiLeuDH-M3的热稳定性明显提升,其半衰期超过2 h,同时发现Na~+和K~+对酶活有明显的促进作用,当浓度达到10 mmol·L~(-1)时,相对酶活提高35%。动力学参数分MLN4924析结果显示,突变体EsiLeuDH-M3对三甲基丙酮酸的k_(cat)/K_m是WT的1.49倍,对辅酶NADH的k_(cat)/K_m是WT的2.29倍。(5)利用重组工程菌催化三甲基丙酮酸制备L-叔亮氨酸。对催化条件进行了优化,结果表明p H 9.5、30℃为最适反应条件。在该条件下当底物浓度达到0.6 M时,WT催化的三甲基丙酮酸转化率仅为78%,而EsiLeuDH-M3催化的转化率几乎接近100%。构建了基于甲酸脱氢酶的NADH再生偶联系统,在该反应体系中当底物浓度为0.7 M时,其转化率达到了91%。