背景与目的:结核病是一种由结核分枝杆菌引起的传染性疾病,对全球健康构成严重威胁。结核病控制所面临的主要挑战是缺乏生物标志物来区分不同感染的状态、评估疾病严重程度;缺乏新的药物靶点和治疗药物来解决结核病的耐药等问题。解析免疫细胞的状态有助于了解结核分枝杆菌感染对宿主防御的影响。不同的感染类型、状态和免疫微环境中,免疫细胞所介导免疫机制也有所不同,全面地了解免疫系统如何整合来自不同细胞类型的信号并协调反应,以及这些细胞类型个体间变异如何导致感染结果的差异至关重要。转录组测序可以揭示基因表达谱的差异,但不能解释细胞中特定亚群的特征。而单细胞测序可用于分析单个细胞的转录谱,揭示复杂异质免疫群体中的细胞身份。某些细胞亚群被认为是控制宿主对疾病的免疫反应或不同疾病状态的标志,如CD4+T和CD8+T细胞在免疫反应的发展中起着关键作用。当暴露于抗原的时间过长时,T细胞逐渐丧失其效应功能,并表现出难以恢复的耗竭表型,即T细胞耗竭。这种耗竭状态可能影响结核分枝杆菌感染的临床表现状态,如疾病严重程度和预后。结核分枝杆菌感染后,耗竭细胞的代谢活动发生了变化,而代谢系统在维持宿主体内平衡方面起着重要的作用,宿主代谢紊乱可能有利于结核病的发展。因此,利CCRG 81045价格用单细胞测序技术联合代谢组学,可以阐述结核感染过程中细胞亚群的动态变化、性质和功能,从而更好地理解结核病的诊断和治疗。方法:首先,通过整理数据库中结核分枝杆菌感染外周血单个核细胞的单细胞测序数据,整合分析不同感染类型的外周血单个核细胞的各亚群细胞通讯差异,同时预测出多种抗结核药物。其次,通过对从健康个体和结核病患者的外周血单个核细胞中分离的CD4+T和CD8+T细胞进行了单细胞测序分析,确定两种T细胞各亚群的特征和变化。通过富集分析等方法,重点阐述了CD8+T细胞功能耗竭的亚群,筛选出了耗竭细胞亚群相关的中枢节点基因,通过分子生物学手段对所筛选的耗竭标志基因进行了验证。此外,利用基于液质联用技术的非靶向代谢组学对结核感染后具有耗竭特征的CD8+T细胞进行分析,得到了差异代谢产物,关注耗竭细胞代谢变化。最后,结合网络药理学、分子对接、分子动力学模拟和生物学实验,确定了柚皮苷抗结核的靶点和作用机制。结果:首先,本文确定了在不同感染类型的外周血单个核细胞内各类细胞的分布与改变,主要包括T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞,确定了不同状态下各细胞亚群之间的细胞通讯特征,发现感染后的细胞通讯强度比感染前强,尤其是在潜伏感染的状态下,细胞通讯强度最强。不同感染类型改变的信号不同,TNF、ITGB2和CLEC等信号通路可以作为标志物来区分肺内外感染,CD6、ALCAM和COLLAGEN则可以用于区分潜伏性感染和活动性结核。同时筛选了不同感染类型可能具有治疗价值的药物,推测柚皮苷、白桦酸、氧氟沙星、新生霉素CL13900与罗特勒林等对结核病的治疗具有一定意义。其次,本文鉴定了外周血中分离的7个CD8+T细胞亚群和8个CD4+T细胞亚群,并阐明了每个亚群的转录组景观变化和特征,尤其是耗竭细胞亚群,发现耗竭的CD4+T和CD8+T细胞具有不同的标记基因和途径。CD8+T耗竭细胞中的CD8-EX3亚群被鉴定为特异性亚群,鉴定出的基因模块进一步确定了影响CD8+T细胞耗竭的关键因素,为结核感染预后提供了潜在标志物。在CD4+T细胞中筛选并验证了两个基因HIFX和VIM可以作为其耗竭标志物,在CD8+T细胞中筛选并验证了4个基因ITM2C、RGS1、IRF1和SATB1作为耗竭标志物的候选。此外,利用基于液质联用技术的非靶向代谢组学技术阐述了CD8+T耗竭特征细胞的代谢变化,正离子模式下共有100个差异代谢物,负离子模式下共有163个差异代谢产物,筛选了四氢姜黄素、谷胱甘肽、伐地那非等作为耗竭相关代谢物,嘌呤代谢、叶酸合成等作为进一步探究的代谢通路。最后,结合网络药理学、分子对接和分子动力学模拟,从蛋白层面确定了柚皮苷可能抗结核的靶点,如PTGS2、CASP3、ESR1和PPARG等,其可影响IL-17、花生四烯酸、细胞死亡与炎症应答等通路,同时通过最低抑菌浓度实验明确了柚皮苷作为抗结核药human medicine物的可能性。以上内容将有助于更全面地了解结核分枝杆菌感染时免疫细胞的变化和特征并制定有效的干预策略,为临床研究提供了新的科学依据和方法路线。结论:1.本文探究了结核分枝杆菌感染不同状态下的外周血单个核细胞中各细胞亚群比例,发现了细胞通讯模式普遍强于健康状态,ITGB2和CLEC等信号通路可用于区分肺内外感染,CD6和ALCAM等信号通路可用于区分潜伏期患者和活动期患者。2.本文探究了活动期肺结核CD8+T细胞和CD4+T细胞的各细胞亚群的组成、变化及特征,确定了HIFX和VIM作为CD4+T细胞的耗竭标记基因,ITM2C、RGS1、IRF1和SATB1作为CD8+T细胞的耗竭标记基因。3.本文探究了感染后耗竭特征细胞代谢变化,发现了正负离子模式下共263个差异代谢物,其中四氢姜黄素、谷胱甘肽和伐地那非等变化显著,并富集到辅因子的生物合成、嘌呤代谢和叶酸合成等通路中。4.本文探究了柚皮苷在蛋白层面治疗结核病的作用机制,发现了其可通过PTGS2、ESR1和PPARG等多靶点以及IL-17、花生四烯酸和炎症应答等多途径发挥抗结核病作用。