目的目前,随着工农业的快速发展,我国重金属的污染状况日益严峻。重金属污染与其他有机化合物的污染不同,它不能够在环境中降解,并且具有富集性,可以通过食物链在人体内发生蓄积,对人民群众的健康安全造成了严重的威胁。广泛存在于原核生物体内负责调控小分子代谢的变构转录因子(Allosteric transcription factors,a TFs)作为新型的分子识别元件被用于生物传感器的构建。基于变构转录因子的无细胞生物传感器具有制备简单、反应快速、特异性强的优点,以变构转录因子为识别元件开发设计新的传感技术来检测水中重金属离子具有一定的实用价值。此外,纸基材料作为无细胞生物传感器的载体具有成本低、便于储存、易于携带的优势,便于现场检测的开展。本研究以水中常见的有毒重金属汞、铅、镉、砷作为研究对象,以变构转录因子为识别元件,依据变构转录因子与双链DNA的相互作用特点,结合无细胞体外转录(in vitro transcription,IVT)体系,构建了重金属无细胞合成检测技术,并且通过滚环转录(Rolling circle transcription,RCT)信号放大技术,进一步提高对于重金属检测的灵敏度。此外,设计开发包含有多个反应室的纸基芯片,以实现在现场条件下对于多种重金属离子的同时检测。本论文的主要研究内容如下:方法1.基于变构转录因子的重金属无细胞合成检测技术研究。基于变构转录因子为分子识别元件结合表达荧光RNA的无细胞体外转录体系,设计了一种新的针对水中重金属离子的检测技术。首先构建以包含T7启动子、变构转录因子结合位点、3WJd B表达基因和T7终止子的双链DNA为反应模板的无细胞体外转录体系;而后运用表面等离子体共振实验(Surface plasmon resonance,SPR)和凝胶迁移实验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)对变构转录因子进行筛选和表征;接下来向无细胞体外转录体系中加入适当浓度的变构转录因子构建无细胞合成检测技术体系;随后设计DNA逻辑电路消除信号串扰;最后通过对实际水样的检测以验证该方法的实用性。方法2.基于变构转录因子的重金属RCT超灵敏检测技术研究。运用RCT的信号放大手段设计了基于变构转录因子用于水中重金属离子的超灵敏检测方法。首先设计制备了包含局部双链的单链环状DNA模板以同时满足变构转录因子的结合和RCT反应进行的需求;而后通过EMSA实验和荧光测量表征该方法检测原理的可行性;接下来进行正交实验SB431542说明书以优化检测体系内变构转录因子的含量;最后设计DNA逻辑电路消除信号串扰。方法3.水中重金属现场快速多重检测纸基芯片的研究。运用设计的微流控芯片搭载冻干的纸基生物传感器实现在现场条件下对于4种重金属的同时检测。首先通过改变变构转录因子的添加量来调整无细胞合成检测技术的检测限;随后对纸基材料及其孔径进行筛选;接下来将无细胞合成检测技术体系通过冷冻干燥的方法固定到纸基材料上构成纸基生物传感器;最后将检测不同重金属离子的检测体系放置到设计的微流控芯片上建成纸基芯片。结果1.基于变构转录因子的重金属无细胞合成检测技术研究:在最佳条件下,通过肉眼对于荧光结果的判读即可实现对0.5 nmol/L Hg~(2+)、0.1 nmol/L Pb~(2+)、10 nmol/L Cd~(2+)及1 nmol/L As~(3+)的检出。通过DNA逻辑电路的引入成功解决了Cd~(2+)检测体系中Pb~(2+)的信号串扰问题。重金属离子在河水中的加标回收率为91.09-123.24%,相对标准偏差(Relative standard deviation,RSD)不大于6.71%,表明该传感技术在实际应用中的潜力。结果2.基于变构转录因子的重金属RCT超灵敏检测技术研究:在最佳检测条件下,该检测方法产生的荧光值与重金属离子浓度的对数存在良好的线性关系,其线性方程分别为Hg~(2+):Y=217.5*X+534.6(R~2=09918),Pb~(2+):Y=161.5*X+617.7(R~2=09856),Cd~(2+):Y=183.8*X+463.6(R~2=09908),As~(3+):Y=177.3*X+549.3(R~2=09821),其中Y为荧光值,X为重金属离子的浓度对数,其检测限分别为0.034、0.006、0.135和0.016 nmol/L(3σ/S),与之前构建的无细胞合成检测技术相比,检测限要低2-3个数量级。结果3.水中重金属现场快速多重检测纸基芯片的研究:确定了以孔径为0.2μm的醋酸纤维素膜为纸基材料,将Hg~(2+)、Pb~(2+)、Cd~(2+)、As~(3+)的检测限根据我国生活饮用水卫生标准分别调整为5 nmol/L、48 nmol/L、45 nmol/L及128 nmol/L,在现场检测的条件下实现了4种重金属离子的定性检测。结论本研究以变构转录因子为分子识别元件,分别与无细胞体外转录体系和RCT反应相结合,实现了对于水中重金属离子的可视化检测和超灵敏检Compound 3 IC50测。选取荧光RNA为荧光信号输出方式,使得荧光信号的产生更加快速并且检测体系的构建更为简捷。此外,依托纸基传感器和微流控芯片构建了纸基芯片,实现了现场条件下对于水中重金属的多重检测。本研究的实验结果证明了两种检测技术的可行性,以及纸基芯片的实用性,为环境水中重金属的监测提供了新的手段,并且为Patrinia scabiosaefolia其他污染物的高通量检测提供了新的解决方案。