类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种常见的自身免疫性疾病,表现为关节及全身多脏器损害,且致残率高,病程缠绵,预后差,给家庭和社会带来沉重的经济负担。RA的病因尚不明确,病理特征为慢性滑膜炎、滑膜增生和血管翳形成,最终导致骨和软骨的渐进式破坏。目前RA缺乏有效的治疗手段,现有治疗药物存在毒副作用明显、停药困难、价格昂贵等问题。中寻找更多医药在治疗RA方面积累了丰富的经验,中药具有疗效肯定和安全性良好的优势,在治疗RA方面发挥重要的作用。金藤清痹颗粒是由首都国医名师房定亚教授汇集数十年的临床经验,在“毒热致痹”病因理论指导下创立的中药新药。毒热是RA重要的中医致病因素之一,并贯穿RA疾病的始终。RA滑膜炎、滑膜血管增生及骨和软骨破坏的病理过程,正是中医“毒热内蕴、入络留瘀、损筋蚀骨”的病机体现。金藤清痹颗粒针对RA毒热内蕴的病机,具有清热解毒、活血消肿、通痹止痛的功效。前期临床研究已证实,金藤清痹颗粒临床疗效确切,安全性良好,可有效缓解RA患者的症状和体征,降低炎症指标,改善关节功能,提高患者生活质量,但是其药效及作用机制尚缺乏系统研究。为此,本研究建立胶原诱导性关节炎(Collagen-induced arthritis,CIA)大鼠模型,评价金藤清痹颗粒干预CIA大鼠的药效学作用,并利用滑膜蛋白质组学、血清代谢组学和肠道菌群16S高通量测序技术,挖掘金藤清痹颗粒潜在的作用靶点和通路,探讨其可能的作用机制,为其临床应用提供基础理论依据。研究一金藤清痹颗粒治疗类风湿关节炎的药效学评价目的:观察金藤清痹颗粒对类风湿关节炎的治疗作用,从抑制炎症反应、滑膜增生、软骨和骨破坏多角度评价金藤清痹颗粒治疗类风湿关节炎的药效学作用。方法:雄性SD大鼠随机分为:正常组、模型组、甲氨蝶呤组(MTX,1mg/kg/w),金藤清痹颗粒低剂量组(1.25g/kg/d),金藤清痹颗粒中剂量组(2.5g/kg/d)和金藤清痹颗粒高剂量组(5g/kg/d),每组10只。使用牛二型胶原和弗氏完全佐剂诱导CIA大鼠模型,加强免疫后给药干预5周,观察各组大鼠关节肿胀和关节炎指数(AI)评分的变化,测量并计算脾脏指数情况,ELISA检测血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平,关节超声检测大鼠滑膜增生情况,关节X线检测大鼠关节骨破坏情况,HE染色观察大鼠关节和脾脏病理学改变,番红O固绿染色观察大鼠软骨损坏情况。结果:(1)对关节肿胀的影响:金藤清痹颗粒对CIA大鼠关节肿胀有明显改善作用,其中高、中剂量组在实验d28、d35、d42时明显低于模型组(P<0.01),同时高剂量组在d35、d42天明显低于低剂量组和MTX组(P<0.05)。(2)对关节炎指数(AI)评分的影响:金藤清痹颗粒对CIA大鼠AI评分有明显改善作用,其中高剂量组在d28、d35、d42时明显低于模型组(P<0.01),中剂量组在d35、d42明显低于模型组(P<0.05,P<0.01),同时高剂量组在d28、d35、d42明显低于低剂量组和MTX组(P<0.05)。(3)对血清炎症因子的影响:金藤清痹颗粒对CIA大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平有明显改善作用,其中高、中剂量组明显低于模型组(P<0.01),同时高剂量组TNF-α、IL-1β、IL-6水平以及中剂量组IL-1β、IL-6水平均明显低于低剂量组(P<0.01)。(4)对关节病理的影响:金藤清痹颗粒对CIA大鼠关节病理有改善作用。模型组滑膜增生明显,滑膜中大量炎性细胞浸润,多处软骨层损伤和骨侵蚀;MTX组滑膜轻度增生,炎性细胞浸润减少,软骨和骨侵蚀减轻;金藤清痹颗粒各剂量组滑膜增生和炎性细胞浸润不同程度减轻,偶见软骨和骨侵蚀。(5)对脾脏指数和脾脏病理的影响:金藤清痹颗粒对CIA大鼠脾脏指数和脾脏病理有改善作用,其中金藤清痹颗粒高剂量组脾脏指数明显低于模型组(P<0.05)。HE染色可见模型组大鼠脾脏白髓及边缘区增生明显,生发中心多见。金藤清痹颗粒各剂量组和MTX组白髓及边缘区增生改善,生发中心减少。(6)对滑膜增生的影响:金藤清痹颗粒对CIA大鼠滑膜增生有明显改善作用。关节超声结果显示,模型组大鼠滑膜增生明显,金藤清痹颗粒高、中剂量组滑膜增生评分明显低于模型组(P<0.01,P<0.05),滑膜增生面积也明显低于模型组(P<0.01),同时高剂量组滑膜增生面积明显低于低剂量组(P<0.01)。(7)对骨破坏的影响:金藤清痹颗粒对CIA大鼠骨破坏有明显改善作用。关节X线结果显示,模型组大鼠关节破坏严重,金藤清痹颗粒高、中剂量组的关节破坏减轻,X线评分明显低于模型组(P<0.01),同时高剂量组X线评分明显低于低剂量组和MTX组(P<0.01,P<0.05)。(8)对软骨损坏的影响:金藤清痹颗粒对CIA大鼠软骨损伤有改善作用。番红O固绿染色结果显示,模型组大鼠的关节表面软骨损坏严重,番红染色着色极低。中、低剂量组和MTX组软骨损坏减轻,番红染色着色不均匀。金藤清痹颗粒高剂量组软骨损坏Navitoclax浓度明显减轻,番红染色着色可。结论:金藤清痹颗粒能够改善CIA大鼠的炎症反应、滑膜增生以及软骨和骨的破坏。研究二基于滑膜蛋白质组学研究金藤清痹颗粒治疗RA的作用机制目的:在证实金藤清痹颗粒具有抗RA作用基础上,通过蛋白质组学技术研究金藤清痹颗粒对CIA大鼠滑膜蛋白的影响,挖掘金藤清痹颗粒抗RA的关键靶点蛋白和信号通路。方法:雄性SD大鼠随机分为金藤清痹颗粒组(5g/kg/d)、模型组和正常组,每组10只。使用牛二型胶原和弗氏完全佐剂诱导CIA大鼠模型,加强免疫后给药干预5周。取各组大鼠的滑膜组织样本,提取蛋白,经质检合格后,利用4D-Label free定量蛋白质组学技术进行检测,筛选组间差异表达蛋白,对差异蛋白进行功能和通路富集分析,找出与金藤清痹颗粒抗RA相关的关键靶点蛋白,并进行Western blot验证。结果:对滑膜样本进行蛋白质组学分析,共鉴定出34619个多肽和4545个蛋白质,其中可定量蛋白4256个。模型组与正常组比较,共鉴定出367个差异蛋白(P<0.05),其中292个上调,75个下调。金藤清痹颗粒组与模型组比较,共鉴定出71个差异蛋白,其中30个上调,41个下调,其中金藤清痹颗粒可显著回调Nfkb1、Pdk1、Pecam1等1 1个差异蛋白表达(P<0.05)。对差异蛋白进行KEGG通路富集分析,结果显示金藤清痹颗粒调控的差异蛋白参与炎症反应和自身免疫相关的信号通路有NF-κB信号通路、IL-17信号通路和Toll样受体信号通路。筛选关键差异蛋白进行Western blot验证,结果表明,与模型组比较,金藤清痹颗粒可以显著抑制滑膜组织中Nfkb1、Pdk1、Pecam1的表达水平(P<0.01,P<0.05,P<0.01),结果与蛋白质组学的结果一致。结论:金藤清痹颗粒对CIA大鼠的滑膜蛋白具有调控作用,可能通过影响NF-κB通路、IL-17通路、Toll样受体信号通路发挥治疗RA的作用,其分子机制与抑制Nfkb1、Pdk1、Pecam1蛋白的表达相关。研究三基于血清代谢组学研究金藤清痹颗粒治疗RA的作用机制目的:在证实金藤清痹颗粒具有抗RA作用基础上,通过代谢组学技术研究金藤清痹颗粒对CIA大鼠血清代谢物的影响,挖掘金藤清痹颗粒抗RA作用的关键代谢物和代谢途径。方法:大鼠分组同研究二,采集金藤清痹颗粒组、模型组、正常组大鼠血清样本,经质检合格后,利用非靶代谢组学技术,筛选组间差异表达代谢物,并对差异代谢物进行功能和通路富集分析。结果:本次研究正负离子模式合并后共鉴定到948种代谢物,组间差异分析表明金藤清痹颗粒组、模型组和正常组的血清代谢物存在明显差异。在正负离子模式下,模型组与正常组比较,共鉴定出99个差异代谢物(VIP>1.0,P<0.05),其中56个上调,43个下调。金藤清痹颗粒组与模型组比较,共鉴定出83个差异代谢Foodborne infection物,其中44个上调,39个下调,其中金藤清痹颗粒可显著回调血清素(Serotonin)、谷氨酸(DL-Glutamic acid)、乳酸(Dl-lactate)、氨基丁酸(3-Aminobutanoic acid)等17个差异代谢物表达(P<0.05)。对差异代谢物进行KEGG通路富集分析发现,差异代谢物主要参与色氨酸代谢(Tryptophan metabolism)、丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢(Alanine,aspartate and glutamate metabolism)、抗坏血酸和醛酸代谢(Ascorbate and aldarate metabolism)、精氨酸代谢(Arginine metabolism)和肌醇磷酸盐代谢(Inositol phosphate metabolism)。结论:金藤清痹颗粒对CIA大鼠血清代谢物紊乱具有一定的调节作用,可能通过影响色氨酸代谢、丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸代谢、抗坏血酸和醛酸代谢发挥治疗作用。研究四基于16S高通量测序研究金藤清痹颗粒治疗RA的作用机制目的:在证实金藤清痹颗粒具有抗RA作用基础上,通过16S高通量测序技术研究金藤清痹颗粒对CIA大鼠肠道菌群的影响,挖掘金藤清痹颗粒抗RA作用的关键菌群。方法:大鼠分组同研究二,采集结肠内容物,经质检合格后,进行16S rDNA高通量测序,对肠道菌群组成进行分类操作单元和物种多样性分析,并筛选组间差异菌群,进行相关性分析。结果:通过OTUs聚类和物种注释,共得到5649个OTUs,各组共有OTUs 884个,其中正常组特有1038个,模型组特有792个,金藤清痹颗粒组特有2569个。物种多样性分析表明金藤清痹颗粒可改变CIA大鼠的肠道菌群结构。三组大鼠肠道菌群门水平上均以厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)最为丰富。在属水平上,与正常组比较,模型组乳杆菌属(Lactobacillus)丰度显著增加(P<0.05),而拟杆菌属(Bacteroides)、瘤胃球菌UCG-010属(RuminococcaceaeUCG-010)、Butyricimonas、Elusimicrobium、uncultured bacterium及gut metagenome的丰度显著降低(P<0.05),经金藤清痹颗粒干预后,上述菌群丰度有恢复的趋势。与正常组比较,模型组棒状杆菌1(Corynebacteriuml)的丰度有下降趋势,经金藤清痹颗粒干预后,其丰度显著增加(P<0.05)。差异菌属与血清差异代谢物和炎症因子的关联分析发现,瘤胃球菌UCG-010属、棒状杆菌属与3-Aminobutanoic acid呈显著正相关(P<0.05),而与Dl-lactate、TNF-α、IL-1β水平呈显著负相关(P<0.05)。乳杆菌属与3-Aminobutanoic acid呈显著负相关(P<0.01),而与D1-lactate呈显著正相关(P<0.01)。结论:金藤清痹颗粒可调节CIA大鼠肠道菌群结构,菌群结构变化与血清代谢物和炎症因子水平具有相关性,拟杆菌属、乳杆菌属、瘤胃球菌UCG-010属、棒状杆菌属1、Butyricimonas可能是金藤清痹颗粒抗RA的关键菌群。