幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)作为一种定植于全世界超过一半人口的胃粘膜层和胃上皮细胞表面的致病菌,其持续感染被认为是导致包括胃癌在内的多种胃部病变的主要非遗传因素。随着全球范围内耐药性的增加,传统抗生素疗法的治愈率不断降低,亟需研发基于新靶点的抗H.pylori感染药物。然而,传统筛选技术的局限性延缓了新型有效药物的发现过程。作为一种生物、化学、电学等多学科交叉技术,生物传感器具有快速、准确、高灵敏度和低检测限等优点,其已展示了在药物研发领域的应用潜力。本文首先分别异源表达了H.pylori的存活、定植与致病阶段的关键生物活性分子。随后以这些生物分子为识别元件设计并构建了三种新型的生物传感器。最后评估了开发的生物传感器筛选抗H.pylori感染新药的应用潜力。基于酶促反应动力学与酶的抑制理论分析了所测化合物的作用类型和强度。此外,通过分子对接手段在氨基酸层面上进一步探讨了候选化合物与其对应生物靶点的相互作用机制。主要研究成果如下:(1)脲酶是H.pylori抵抗胃酸环境的关键分子。在异源表达H.pylori 26695脲酶b亚基(H.pylori urease b subunit,HPUb)的基础上通过层层组装构建了 HPUb/铂纳米颗粒(Platinum nanoparticles,Pt)/纳米多孔金(Nanoporous gold,NPG)/玻碳电极(Glassy carbon electrode,GCE)生物传感器。基于脲酶对尿素的专一性水解和Pt纳米颗粒对NH3的高效电催化氧化的两步催化反应实现了尿素的检测和脲酶抑制剂的快速筛选。结果表明,所测化合物:乙酰氧肟酸(Acetohydroxamic acid,AHA)、甲基脲(methylurea)、乙酰胺(acetamide)、甲酰胺(formamide)及羟基脲(hydroxyurea)对HPUb的抑制常数分别为 Ki,AHA=5.0397mmol/L,Ki,hydroxyurea=6.2012mmol/L,Ki,methylurea =0.3038mmol/L,Ki,acetamide=0.3866mmol/L,Ki,formamide=2.4747mmol/L。这表明它们对HPUb 的抑制强度顺序为:methylurea>acetamide>formamide>AHA>hydroxyurea。此外,通过分子对接模拟在氨基酸水平的相互作用分析揭示了抑制剂分子结构中的羰基和伯胺基以及HPUb活性口袋的GLY279、ASP362和ALA365在脲酶抑制中的重要作用。结合脲酶抑制剂的抑制常数以及脲酶抑制剂与HPUb的分子结合机制,可以推断基于尿素分子结构对其中一个伯胺基进行非极性长链修饰是高效脲酶抑制剂的发展方向。(2)H.pylori生物膜形成的重要组成部分AlpB外膜蛋白作为筛选抗生物膜药物的生物识别元件。基于AlpB的异源表达构建了一种新型AlpB/胶体金(Colloidal gold,CG)/NPG/Nafion-还原氧化石墨烯(Reduced graphene oxide,rGO)/GCE 生物传感器。通过影响AlpB外膜蛋白的粘附性产生可检测的电信号。所制备的基于AlpB的生物传感器不仅成功识别了六种抗生物膜药物:S-(羧甲基)-L-半胱氨酸(S-(Carboxymethyl)-L-cysteine,SCC)、大蒜素(allicin)、姜黄素(curcumin)、红霉素(erythromycin)、利福平(rifampicin)及 N-乙酰-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-Cysteine,NAC),还通过相互作用动力学分析评价了不同抗生物膜药物BLZ945与AlpB结合的敏感性和作用强度。AlpB对六种抗生物膜药物的敏感性顺序为:allicin>erythromycin>SCC>curcumin>rifampicin>NAC,六种抗生物膜药物对AlpB的作用强度为:rifampicin>NAC>allicin>erythromycin>SCC>curcumin。其中,allicin 具有最显著的 AlpB 敏感性,rifampiGSK2118436cin显示出了最大的作用强度。此外,分子对接结果显示六种抗生物膜药物可能通过自发结合到AlpB蛋白的保守区以发挥抗生物膜作用。(3)裂解转糖基酶Cag4的局部肽聚糖层裂解能力是维持H.pylori基于细胞毒素相关基因A(Cytotoxin-associated gene A,CagA)分泌的致癌能力的基础。以异源表达的H.pylori 26695 Cag4为生物识别元件构建了基于酶-无机共催化信号转化策略的Cag4/NPG/Nafion-rGO/NPG/GCE生物传感器用于Cag4变构调节剂的筛选。检测过程中,Cag4首先切割肽聚糖的N-乙酰葡糖胺(N-Acetyl-D-glucosamine,NAG)和N-乙酰胞壁酸(N-acetyl-β-D-muramic acid,NAM)之间的β-1,4糖苷键,释放出来的NAG随后被NPG电催化氧化从而产生响应电流biomimetic robotics。结果表明,壳聚糖(chitosan)或羧甲基壳聚糖(carboxymethyl chitosan)是一种非竞争与反竞争组合的混合型Cag4抑制剂。抑制常数分别为 Ki’chitosan=0.88909 mg/mL,Ki’carboxymethyl chitosan=1.13480 mg/mL。令人意想不到的是,D-(+)-纤维二糖(D-(+)-cellobiose)显示出了降低Cag4催化裂解细胞壁的Ka值29.7%和显著提升Vmax值71.3%的激活效应。此外,分子对接揭示了以葡萄糖为主体结构的C2取代基团的极性在Cag4变构调节剂中的重要性。本文设计并构建三种不同的生物传感器实现了分别靶向H.pylori存活、定植与致病阶段的关键生物活性分子的抗H.pylori感染新药的筛选。其中,methylurea、allicin和chitosan具备进一步研究的价值。通过结合生物传感器筛选实验结果与分子对接模拟分析初步阐明了竞争性脲酶抑制剂、抗生物膜药物以及Cag4变构调节剂的结构与功能的关系。本研究为潜在的抗H.pylori感染药物筛选提供了一个快速高效的检测平台,同时为针对这三个生物靶点的新药研发奠定了理论基础和新思路。