背景与目的:在肿瘤临床研究中,数字PCR以高灵敏度高精准度的特点可以检测出液体活检中核酸含量低的目标基因突变,对肿瘤患者进行早期诊断以及实时监测患者治疗疗效并预测肿瘤复发转移有临床应用价值,从而实现肿瘤患者的个体化精准治疗。为了建立稳定的数字PCR反应体系,本研究首先利用肝癌术后组织标本DNA进行检测并优化,建立了稳定的数字PCR反应体系,并验证了使用数字PCR检测热突变位点可以提高评估肝癌患者预后的效能。为了进一步将数字PCR应用于临床,减轻尿路上皮癌(Urothelial Carcinoma,UC)患者因侵入性检测方式带来的创伤,以及辅助尿脱落细胞学检查提高对尿路上皮癌的诊断效能,我们通过非侵入性方式采集尿路上皮癌患者尿液样本对其热突变位点进行数字PCR检测,探讨利用数字PCR技术联合尿脱落细胞学检查对尿路上皮癌的诊断效能。方法:首先我们对肿瘤纯度大于60%的66例肝癌术后组织样本提取DNA,使用传统的Sanger测序和数字PCR技术对TERT启动子区C228T突变进行检测;为制定出数字PCR对突变样本的判读标准,我们建立了空白检出限(Limit of Blank,LoB)和检出限(Limitof Detection,LoD),为优化数字PCselleck产品R反应条件不断调整特殊化学试剂类型及浓度。利用Cohen’s Kappa指数比较Sanger测序与数字PCR间一致性。根据预后资料绘制Kaplan-Meier曲线和Cox比例风险模型分析。采用多因素Cox回归构建OS和DFS的Nomogram模型,并使用R软件“rms”包生成用于预测OS和DFS的列线图。运用时间依赖型受试者工作特征曲线(ROC)、校准曲线和决策曲线分析(DCA),来验证预测模型的准确性和在临床中的有效性。纳入本研究的研究对象:214例NCC细胞学送检尿液患者,14例河南省人民医院血尿患者,48例正常对照组。收集尿液,并提取尿cfDNA。应用数字PCR检测尿cfDNA中TERT C228T/C250T突变。设定判定标准时,建立LoB与LoD值。将有统计学意义的单因素分析结果纳入多因素Logistic回归模型,筛选出影响诊断尿路上皮癌的独立因素和影响尿路上皮癌患者TERT突变的临床特征,建立预测模型。计算TERT突变拷贝数浓度在不同临床资料分组中的分布。使用ROC曲线、校准曲线验证预测模型的诊断效能。另外收集27例UC患者尿液并提取尿cfDNA,采用液滴式数字PCR(droplet digital Polymerase Chain Reaction,ddPCR)检测尿 cfDNA 中 S249C 突变情况。应用ROC评价尿cfDNA中FGFR3 S249C突变对于尿脱落细胞学诊断不明确UC患者的诊断效能。结果:①在肝癌中使用Sanger测序检测到39.39%(26/66)TERT C228T突变,数字PCR检测判定样本突变的阈值为0.55 cp/μL,对66例样本中有45.45%(30/66)TERT C228T突变。两种检测方法有较好的一致性(准确度=93.939,Kappa=0.876),数字PCR对TERT C228T的灵敏度为100%,特异度为90%。相比于野生型,突变型的HBV相关HCC患者生存率降低,复发风险增加。构建HBV相关HCC患者预后的OS和DFS预测模型,C指数分别为0.7651和0.6899。②对尿路上皮癌患者尿cfDNA进行数字PCR可检测出TERT C228T和C250T的检出限为0.546 cp/μL和0.545 cp/μL。TERT C228T在NCC患者中突变率为30.8%(66/214),在河南省人民医院血尿组和正常对照组中为0;TERTC250T在NCC患者中突变率为9.3%(20/214),在河南省人民医院血尿组为7.14%(1/14),正常对照组中为0。TERT C228T/C250T在三组中突变率分别为36.4%(78/214),7.14%(1/14),0。TERT C228T或C250T突变状态与患者年龄(P=0.049)、细胞学分类(P=0.001)、细胞学可疑为界限(P<0.001)、随访结果(P<0.001)和是否浸润(P=0.019)有关。TERT C228T/C250T的突变拷贝数浓度随着细胞学的分类有上升趋势,且在肌层浸润UC和随访结果为UC组中含量高。单多因素Logistic回归筛选出年龄(P=0Redox biology.013)、TERT C228T/C250T(P<0.001)为突变型以及细胞学以可疑癌(P<0.001)均为影响UC的独立因素。细胞学不明确且TERT C228T/C250T有突变和未突变对UC的检出率分别为30.5%(50/164)和22.6%(37/164)。TERT C228T/C250突变可提高尿脱落细胞学对诊断不明确UC的检出率。③UC患者尿cfDNA中FGFR3 S249C突变的检出率为25.9%(7/27)。按尿液细胞学巴黎报告系统(TPS)分类,FGFR3 S249C突变在高级别尿路上皮癌(HGUC)中检出率为18.8%(3/16),可疑高级别尿路上皮癌(SHGUC)中为50%(4/8),未见高级别尿路上皮癌(NHGUC)中为0(0/3)。FGFR3 S249C在非浸润性UC中的突变率为25.0%(1/4),在浸润性UC中为31.6%(6/19)。在尿脱落细胞学诊断为SHGUC的样本中使用ddPCR检测出的FGFR3 S249C突变对于UC有50%(4/8)的检出率,且 ROC 曲线下面积为 0.781,95%CI(0.407,1.000),在UC诊断中起到良好的辅助作用。结论:使用数字PCR检测TERT启动子突变有望成为评估HCC患者术后复发的潜在分子标志物。数字selleckchem DolutegravirPCR与尿脱落细胞学检查相联合可以提高对尿路上皮癌的诊断效能。这些研究结果表明,应用数字PCR检测肝癌和尿路上皮癌时构建的预测模型为临床医生制定精准治疗策略提供一定的参考价值。