研究背景:全球有大约2.96亿人患有由乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)引起的慢性乙型肝炎,每年由于HBV感染相关并发症引起的死亡人数高达88万人。目前治疗乙型肝炎的主要药物只能抑制病毒复制和减轻相关并发症,但药物的副作用多且治愈率低,以及HBV耐药株的发展等问题,使得研发治疗效果好、副作用低且不易诱导病毒产生耐药性的新型药物迫在眉睫。目的:本课题旨在筛选茯苓萜类中具有抗乙肝病毒活性的成分,并初步探讨其潜在的抗乙肝病毒的机制。为茯苓药材的进一步开发利用和对抗乙肝病毒新药研发提供重要实验依据。方法:1、通过TCMSP和Swiss ADME等数据库,筛选具有活性的茯苓萜类成分,然后使用Swiss Target Prediction和Gene Cards等数据库预测茯苓萜类和乙肝病毒的相关靶点,并用Venny工具获取茯苓萜类成分和乙肝病毒的交集靶点。将交集靶点信息导入STRING数据库后,使用Cytoscape 3.7.2软件构建并分析“成分-靶点-疾病”和蛋白互作(PPI)网络;通过DAVID数据库分析交集靶点的GO功能和KEGG通路富集情况,并绘制“成分-靶点-通路”网络,筛选茯苓萜类抗乙肝病毒的活性成分、关键靶点和潜在通路;分子对接分析活性成分与关键靶点的结合效果。2、通过MTT检测化合物对Hep G2.2.15细胞的毒性;ELISA法检测化合物对Hep G2.2.15细胞中HBs Ag、HBe Ag分泌的抑制情况;PCR-荧光探针法检测化合物对Hep G2.2.15细胞中HBV-DNA表达的影响;3、通过Western blot实验方法,研究化合物对Hep G2.2.15细胞中STAT3、p-STAT3、JAK2、p-JAK2蛋白表达的影响;分子动力学模拟方法动态分析化合物与蛋白的结合效果。结果:1、网络药理学筛选获取具有活性的茯苓萜类成分18个,成分相关靶点200个,HBV相关靶点1385个,萜类成分与乙肝病毒交集靶点119个。“成分-靶点-疾病”网络筛选得到5个核心成分,PPI网络筛选得到5个核心靶点。使用DAVID数据库进行交集靶点的GO和KEGG富集分析,共得到570个GO条目(P<0.01),主要与JAK-STAT级联反应、炎症的调控及蛋白磷酸化等多个生物学过程相关;KEGG筛选到126条通路(P<0.01),主要涉及病原体感染、炎症-免疫反应、信号调节相关的信号通路。通过拓扑分析“成分-靶点-通路”网络,筛选出3个抗乙肝病毒活性成分:分别是去氢茯苓酸、齿孔酸和栓菌酸;5个关键靶点:JAK2、STAT3、MAPK3、PIK3CA和EP300;3条潜在通路:JAK-STAT、PI3K-Akt和MAPK信号通路。通过分子对接分析活性成分和关键靶点的相互作用,发现去氢茯苓酸、齿孔酸和栓菌酸与JAK2和STAT3间的对接相互作用能大于靶点原配体,且活性成分与靶点之间形成多个利于结合的作用力,对接效果良好。3、MTT实验结果显示,去氢茯苓酸(20、40、60μmol/L)和齿孔酸(10、20、40μPUN30119价格mol/L)作用Hep G2.2.15细胞3天后,细胞存活率均大于90%,细胞毒性小。ELISA检测选定细胞上清液中HBe Ag和HBs Ag的含量,发现去氢茯苓酸和齿孔酸作用3天对后两种病毒抗原的分泌均有抑制作用,其中去氢茯苓酸浓度为20μmol/L时,对HBs Ag和HBe Ag的抑制作用最好,抑制率分别为47.88±0.95%和31.43±1.48%(P<0.01);齿孔酸浓度为20μmol/L时,对HBs Ag和HBe Ag的抑制作用最好,抑制率分别为29.74±1.45购买Docetaxel%和9.96±0.18%(P<0.01)。且去氢茯苓酸和齿孔酸对乙肝病毒抗原分泌的抑制效果均比阳性药拉米夫定(200μmol/L)更优。PCR检测药物作用细胞6天后的HBV-DNA的含量,结果显示去氢茯苓酸在对细胞毒性小的浓度下(20、40、60μmol/L)具有抑制HBV-DNA复制的作用,浓度为60μmol/L时抑制率最好为53.78%(P<0.01);齿孔酸在对细胞head impact biomechanics毒性较小的浓度下(10μmol/L),对细胞上清液中HBV-DNA的表达无抑制作用(P<0.01)。5、Western blot实验表明,当去氢茯苓酸浓度为40和60μmol/L时能显著抑制细胞内p-STAT3和p-JAK2蛋白的表达(P<0.01),浓度为60μmol/L时能显著抑制STAT3和JAK2蛋白表达(P<0.01)。分子动力学模拟结果显示,去氢茯苓酸与靶点STAT3稳定结合。结论:1、网络药理学与分子对接方法预测,茯苓萜类中抗乙肝病毒的活性成分为去氢茯苓酸、齿孔酸和栓菌酸。活性成分可能通过影响JAK2和STAT3蛋白表达,从而影响蛋白相关信号通路发挥抗乙肝病毒活性。2、通过体外细胞实验证明去氢茯苓酸和齿孔酸在对Hep G2.2.15细胞毒性小的浓度下,可以抑制细胞内HBs Ag和HBe Ag抗原的分泌,抑制作用比阳性药拉米夫定更好。并且去氢茯苓酸可抑制Hep G2.2.15细胞中HBV-DNA的表达。3、去氢茯苓酸可抑制Hep G2.2.15细胞内STAT3和JAK2蛋白及其磷酸化蛋白的表达。分子动力学显示去氢茯苓酸与STAT3具有良好的动态结合效果。去氢茯苓酸抑制STAT3和JAK2靶点相关信号通路可能是其发挥抗乙肝病毒活性的作用机制之一。