目的:肥胖患者脂肪组织M1型巨噬细胞通过分泌高表达miR-155的外泌体远程介导肝脏胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)。大黄黄连泻心汤可明显增强2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)患者肝脏胰岛素敏感性,但尚不明确其作用机制是否与调控脂肪组织M1型巨噬细胞来源的外泌体(M1 macrophages-derived exosomes,M1-Exo)miR-155的表达有关。本研究将以M1-Exo miR-155为切入点探讨大黄黄连泻心汤改善肥胖型T2DM小鼠肝脏IR的分子机制。方法:动物实验:HFD喂养C57BL/6J雄性小鼠16周构建肥胖型T2DM模型并随机分为Model组、ROSI组、L-DHHL组、M-DHHL组和H-DHHL组,以同周龄健康C57BL/6J雄性小鼠作为Normal组。不同剂量大黄黄连泻心汤干预4周后检测FBG并进行OGTT实验和ITT实验;收集血清检测FINS、TG、TC、HDL-C、LDL-C、TNF-α、IL-1β、MCP-1和IL-10的表达;收集肝脏组织拍照称重,HE染色观察病理变化,qPCR法检测miR-155的表达,WB法检测胰岛素刺激下p-AKT/AKT和膜GLUT4的表达;收集附睾脂肪组织称重,HE染色观察病理变化,qPCR 法检测 TNF-α、IL-1β、MCP-1 和 IL-10 mRNA 及 miR-155 的表达,WB法检测TLR4、IκB-α、细胞质NF-κB p65和细胞核NF-κB p65的表达,FCM检测巨噬细胞极化。细胞实验:1.LPS刺激RAW264.7巨噬细胞构建M1型巨噬细胞模型,不同剂量大黄黄连泻心汤干预48h。ELISA法检测上清液TNF-α、IL-1β、MCP-1和IL-10的表达,qPCR法检测miR-155的表达,WB法检测TLR4、IκB-α、细胞质NF-κB p65和细胞核NF-κB p65表达,FCM检测巨噬细胞的极化;超速离心法提取各组上清液中的外泌体,通过TEM、NTA和WB法进行外泌体鉴定,BCA法检测外泌体的蛋白浓度,qPCR法检测外泌体miR-155的表达;2.LPS刺激RAW264.7巨噬细胞构建M1型巨噬细胞模型,不同剂量的大黄黄连泻心汤干预48h后提取外泌体与肝细胞共培养,共聚焦显微镜观察肝细胞对外泌体的摄取,qPCR法检测miR-155的表达,WB法检测PPAR-γ的表达。结果:动物实验:1.模型鉴定:本次造模共有40只小鼠符合肥胖型T2DM诊断标准,成模率为 53.33%。2.一般指标:(1)粪便:与Model组相比,DHHL各剂量组小鼠排便次数增多,质地变稀;(2)进食及饮水:与Model组相比,DHHL各剂量组小鼠进食量和饮水量降低;(3)体重:与Normal组相比,Model组体重增加(P<0.01)。与Model组相比,M-DHHL组和H-DHHL组体重降低(P<0.05或P<0.01)。3.糖代谢指标:(1)与Normal组相比,Model组OGTT AUC及ITT AUC升高(P<0.01)。与Model组相比,DHHL各剂量组OGTTAUC及ITTAUC均降低(P<0.05 或P<0.01)。(2)与 Normal 组相比,Model 组 FBG、FINS和 HOMA-IR 升高(P<0.01)。与 Model 组相比,M-DHHL 组和 H-DHHL 组FBG降低(P<0.05),DHHL各剂量组FINS和HOMA-IR降低(P<0.05或P<0.01)。4.脂质代谢指标:(1)与Normal组相比,Model组TC、TG和LDL-C的表达升高(P<0.01或P<0.05),HDL-C的表达降低(P<0.05)。与Model组相比,DHHL各剂量组TG的表达降低(P<0.01或P<0.05),H-DHHL组HDL-C的表达升高(P<0.05)。5.肝功能:与Normal组相比,Model组ALT和AST的表达升高(P<0.01)。与Model组相比,DHHL各剂量组ALT的表达降低(P<0.01),H-DHHL组AST的表达降低(P<0.05)。6.肝脏和附睾脂肪组织的重量及系数:(1)与Normal组相比,Model组小鼠肝脏重量和肝脏系数增加(P<0.01)。与Model组相比,DHHL各剂量组肝脏重量降低(P<0.05或P<0.01),M-DHHL组和H-DHHL组的肝脏系数降低(P<0.01)。(2)与Normal组相比,Model组小鼠附睾脂肪组织的重量和附睾脂肪组织系数增加(P<0.01)。与Model组相比,M-DHHL组和H-DHHL组的附睾脂肪组织重量降低(P<0.05或P<0.01),M-DHHL组附睾脂肪组织系数降低(P<0.05)。7.肝脏形态学变化:与Normal组相比,Model组小鼠肝脏颜色变淡偏黄,体积增大,质地稍韧,形态饱满,薄膜紧张,边缘变钝。与Model组相比,DHHL各剂量组肝脏体积明显变小,质地变软,颜色明显红润,但仍不及Normal组。8.肝脏和脂肪组织的HE染色:(1)Model组小鼠肝细胞肿大,细胞排列紊乱,充满大量大小不等脂肪空泡,病变成灶状分布。DHHL各剂量组肝脏的脂肪空泡明显减少。(2)与Normal组相比,Model组附睾脂肪细胞面CHIR-99021积增大(P<0.01)。与Model组相比,DHHL各剂量组附睾脂肪细胞的面积减小(P<0.01)。9.肝脏IR相关指标:(1)与Normal组相比,Model组小鼠肝脏miR-155的表达增高(P<0.01),PPAR-γ的表达降低(P<0.01)。与Model组相比,M-DHHL组和H-DHHL组miR-155的表达降低(P<0.05),PPAR-γ的表达升高(P<0.05或P<0.01)(2)与Normal组相比,在胰岛素刺激下,Model组肝脏p-AKT/AKT和膜GLUT4的表达降低(P<0.01)。与Model组相比,DHHL各剂量组膜GLUT4的表达均升高(P<0.01),M-DHHL组和H-DHHL组p-AKT/AKT 升高(P<0.05)。10.脂肪组织炎症反应相关指标:(1)与Normal组相比,Model组外周血TNF-α、IL-1β和 MCP-1 的表达增加(P<0.01),IL-10 的表达降低(P<0.01)。与Model组相比,DHHL各剂量组IL-1β和MCP-1的表达均降低(P<0.05或P<0.01),M-DHHL 组和 H-DHHL 组 TNF-α的表达降低(P<0.05 或P<0.01),IL-10 的表达升高(P<0.05)。(2)Model 组附睾脂肪组织 IL-1β、TNF-α、MCP-1 mRNA和miR-155的表达升高(P<0.05或P<0.01),IL-10 mRNA的表Digital PCR Systems达降低(P<0.05 或P<0.01)。与 Model 组相比,M-DHHL 组和 H-DHHL 组 IL-1β、TNF-α、MCP-1 mRNA 和 miR-155 的表达降低(P<0.05 或P<0.01),H-DHHL组 IL-10 mRNA 的表达升高(P<0.05 或P<0.01)。(3)与 Normal 相比,Model组TLR4和细胞核NF-κB p65的表达升高(P<0.01),IκB-α和细胞质NF-κB p65的表达降低(P<0.01)。与Model组相比,M-DHHL组和H-DHHL组TLR4和细胞核NF-κB p65的表达降低,IκB-α和细胞质NF-κB p65的表达升高(P<0.05或P<0.01),L-DHHL组TLR4和细胞核NF-κB p65的表达降低(P<0.05)。(4)与Normal组相比,Model组M1型巨噬细胞比例升高(P<0.01),M2型巨噬细胞比例降低(P<0.01),M1/M2比值升高(P<0.01)。与Model组相比,H-DHHL组M1型巨噬细胞比例降低(P<0.01),M2型巨噬细胞比例升高(P<0.01),M1/M2 比值降低(P<0.01)。与 Model 组相比,M-DHHL 组 M1型巨噬细胞比例和M1/M2比值降低(P<0.01)。细胞实验:1.巨噬细胞形态学变化:与Normal组相比,Model组巨噬细胞聚集现象减少,胞体增大,伪足生长丰富,形态不规则。DHHL各剂量组巨噬细胞体积减小,伪足变短。2.M1型巨噬细胞炎症因子及miR-155的表达:与Normal组相比,Model组IL-1β、TNF-α、MCP-1、IL-10 和 miR-155 表达升高(P<0.01)。与 Model 组相比,DHHL 各剂量组 IL-1β、TNF-α、MCP-1 和 miR-155 的表达降低(P<0.05或P<0.01),IL-10的表达升高(P<0.05或P<0.01)。3.M1型巨噬细胞TLR4/NF-κB信号通路相关指标:与Normal组相比,Model组TLR4和细胞核NF-κB p65的表达升高(P<0.01),IκB-α和细胞质NF-κB p65的表达降低(P<0.01)。与Model组相比,M-DHHL组与H-DHHL组TLR4和细胞核NF-κB p65的表达降低(P<0.01),IκB-α和细胞质NF-κB p65的表达升高(P<0.01)。与 Model 组相比,L-DHHL 组 TLR4 表达降低(P<0.05),IκB-α和细胞质NF-κB p65的表达升高(P<0.05)。4.巨噬细胞极化相关指标:与Normal组相比,Model组M1型巨噬细胞比例、M2型巨噬细胞比例和M1/M2比值均升高(P<0.05或P<0.01)。与Model组相比,M-DHHL组和H-DHHL组M1型巨噬细胞比例降低,M2型巨噬细胞比例升高和M1/M2比值降低(P<0.01)。5.M1-Exo 的分泌及 M1-Exo miR-155 的表达:(1)与 Normal 组相比,Model组外泌体浓度和外泌体miR-155的表达增加(P<0.01)。与Model组相比,DHHL各剂量组外泌体miR-155表达均降低(P<0.05或P<0.01)。与Model组相比,M-DHHL组和H-DHHL组外泌体浓度降低(P<0.05或P<0.01)。6.肝细胞miR-155/PPAR-γ相关指标:(1)肝细胞摄取外泌体后,pri-miR-155的表达无明显变化。与PBS组相比,Model-Exo组miR-155表达升高(P<0.01),PPAR-γ 表达降低(P<0.01)。与 Model-Exo 组相比,L-DHHL-Exo 组、M-DHHL-Exo组和H-DHHL-Exo组肝细胞miR-155的表达降低(P<0.05或P<0.01),PPAR-γ表达升高(P<0.01)。结论:1.大黄黄连泻心汤可降低肥胖型T2DM小鼠selleck HPLC进食、饮水、体重、附睾脂肪组织和肝脏的重量及脏器系数。2.大黄黄连泻心汤可改善肥胖型T2DM小鼠FBG、FINS、HOMA-IR、TG和HDL-C等糖脂代谢等指标。3.大黄黄连泻心汤可减小肥胖型T2DM小鼠附睾脂肪细胞面积和肝脂肪变性,同时降低AST和ALT。4.大黄黄连泻心汤可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路降低M1型巨噬细胞极化,促进M2型巨噬细胞极化,从而降低肥胖型T2DM小鼠脂肪组织炎症反应。5.大黄黄连泻心汤可通过抑制脂肪组织M1-Exo的分泌及M1-Exo miR-155的表达,从而改善肥胖型T2DM肝脏IR。