癌症的早期诊断对于赢得治疗时间和降低死亡率至关重要。液体活检作为一种无创诊断技术,较之传统的诊断方法具有病变发现及时、安全无并发症、能够预测病情发展、指导精准治疗及预后等优势。循环RNA是液体活检的一类目标物。microRNA(miRNA)是一类具有18-24个核苷酸的单链非编码RNA,主要通过转录后抑制来调节靶基因的表达。某些miRNA的异常表达与癌症等疾病密切相关,因而被确定为生物标志物。外泌体是一类细胞外囊泡,它们在体液中循环,通过将其内部物质从供体细胞转移至受体细胞来介导细胞间通讯并调节受体细胞的功能。外泌体是miRNA的主要载体,其内部miRNA的浓度变化可由疾病进展过程中的生理变化触发并且具有抗RNase降解的高稳定性。因此,对外泌体miRNA的灵敏检测显示出在癌症液体活检中的巨大潜力。传统方法较差的便携性、复杂的程序和昂贵的仪器正促使开发新的RNA检测技术。具有灵敏度高、操作简便和测定均匀液体的高重现性的荧光法是一种被广泛应用的传感方法。由于具有自参考能力,比率荧光策略能够通过计算具有不同发射波长的不同荧光物质的荧光强度比值来抵消环境因素的影响,使检测结果更加可靠。纳米材料具有独特的界面、力学和光学性质,使得基于利用纳米材料对外泌体miRNAselleck抑制剂进行灵敏检测的新策略的开发成为可能。结直肠癌(CRC)的发病率和死亡率居于各种癌症的前列,其发病隐匿,早期阶段难以发现,超过50%的患者在诊断时已经转移。因此,迫切需要开发新的CRC诊断策略。本论文以实现miRNA的灵敏检测为目标,构建了系列基于荧光纳米材料的比率型传感器,以CRC相关的外泌体miRNA为目标物测试了所构建传感器的检测性能。主要研究内容如下:(1)基于碳点和吖啶橙之间荧光共振能量转移(FRET)的比率型荧光传感器。吖啶橙和荧光碳点分别作为FRET系统的供体和受体。利用目标miRNA的互补DNA序列修饰的SiO2微球从样本中提取目标miRNA。当目标miRNA不存在时,阳离子染料吖啶橙和表面带负电荷的碳点分别吸附于DNA探针的磷酸根侧和碱基侧。距离接近导致吖啶橙和碳点之间发生FRET,吖啶橙的荧光减弱而碳点的荧光增强。当目标miRNA存在时,DNA探针和目标miRNA杂交形成双链,碱基被包裹并且磷酸根暴露,双链的表面带负电荷。吖啶橙嵌入双链的碱基对间隙,而碳点由于碱基被包裹和静电排斥作用远离双链。距离较远导致吖啶橙和碳点之间的FRET减弱甚至消失,吖啶橙的荧光增强而碳点的荧光减弱。吖啶橙和碳点的荧光强度比值与目标miRNA的浓度呈正相关。荧光谱和荧光寿命分析证明FRET能够发生,荧光测试证明该检测策略可行。该传感器的线性检测区间为1-9 nM,检测限为0.14nM。此外,该传感器对目标miRNA显示出良好的选择性,对血清和水中具有相同浓度的目标miRNA(1、5、9 nM)的检测结果接近,并且能够反映CRC患者与健康者的外泌体miRNA浓度差异。(2)基于多壁碳纳米管@金纳米簇(MWCNTs@AuNCs)和双链特异性核酸酶(DSN)辅助信号放大的比率型荧光传感器。对MWCNTs进行羧基修饰以获得良好的水溶性,进一步修饰巯基并使MWCNTs与荧光Au NCs通过Au-S键连接,所获得的MWCNTs@Au NCs兼具荧光发射和荧光猝灭的功能。当目标miRNA不存在时,荧光染料Atto-425修饰的单链DNA探针吸附于MWCNTs@Au NCs的表面,Atto-425的荧光通过能量转移和电荷转移被猝灭。当目标miRNA存在时,DNA探针和目标miRNA形成双链并离开MWCNTs@Au NCs的表面,Atto-425恢复荧光发射。DSN能够特异性地切割双链中的DNA探针并释放miRNA,被释放的miRNA继续与其它DNA探针杂交导致更多的Atto-425恢复荧光发射。MWCNTs@AuNCs的稳定荧光和Atto-425的变化荧光构成比率荧光系统。目标miRNA的浓度与ΔAtto-425和MWCNTs@Au NCs的荧光强度比值呈正相关。荧光测试证明该检测策略可行。通过优化MWCNTs@Au NCs的用量、MWCNTs@Au NCs与DNA探针的混合时间、孵育温度等实验条件,获得了 0.1-10 pM的线性检测区间和0.031 pM的检测限。DSN的特异性切割确保了检测的选择性。该传感器与RT-qPCR的检测结果接近,显示出良好的检测精度。(3)基于荧光金属MS-275体内有机框架(MOF-525)和目标物触发滚环扩增(RCA)的比率型荧光传感器。首次利用MOF-525的荧光性质构建传感器,MOF-525具有荧光猝灭和荧光参考的双重功能。当目标miRNA不存在时,MOF-525能够吸附报告子(一条修饰有荧光染料FAM的DNA单链)并通过光诱导电子转移猝灭FAM的荧光。当目标miRNA存在时,触发RCA反应从而生成一条周期性长链,报告子的序列和周期性长链的部分序列互补从而形成双链。由于MOF-525不能吸附核酸双链,FAM的荧光不能被猝灭。目标miRNA的浓度与Δ报告子和MOF-525的荧光强度比值呈正相关。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和荧光测试证明该检测策略可行。该传感器的线性检测区间为0.1-10pM,检测限为0.03 pM。此外,该传感器能够明显地区分目标miRNA和错配序列,显示出良好的选择性;其检测结果与RT-qPCR接近,显示出用于miRNA检测的潜力。(4)基于由DNA探针(探针P1)为模板的银-金纳米颗粒(Ag-Au NPs/P1)和金纳米颗粒/石墨相氮化碳(Au NPs/g-C3N4)组成的纳米平台、催化发夹组装(CHA)以及序列诱导荧光增强的比率型荧光传感器。将Au NPs与g-C3N4复合,获得了具有增强的荧光猝灭能力的Au NPs/g-C3N4;同时,g-C3N4的荧光起到参考作用。将具有优异的荧光稳定性的Ag-Au NPs/P1作为荧光探针。此外,设计了参与CHA反应的探针P2和P3。当目标miRNA不存在时,Au NPs/g-C3N4能够吸附Ag-Au NPs/P1并通过光诱导电子转移猝灭其荧光。当目标miRNA存在时,触发C HA反应并形成不被Au NPs/g-C3N4吸附的Ag-Au NPs/P1-P2-P3双链结构。miRNA被释放并且继gastroenterology and hepatology续与其它的Ag-Au NPs/P1杂交,形成基于CHA的信号放大循环,使更多的Ag-Au NPs/P1恢复荧光发射。此外,核酸序列设计使得双链结构中P2的鸟嘌呤与P1的连续胞嘧啶靠近,导致Ag-Au NPs/P1的荧光强度增高,检测信号由此进一步增强。由Au NPs/g-C3N4的稳定荧光和Ag-Au NPs/P1的变化荧光构成的比率荧光系统指示目标miRNA的浓度。非变性PAGE和荧光测试证明该检测策略可行。通过对检测系统的溶液pH、Au NPs/g-C3N4的用量和孵育时间等实验条件进行优化,获得了 0.1-50 pM的线性检测区间和0.047 pM的检测限。此外,该传感器能够明显地区分目标miRNA和错配序列,其检测结果与RT-qPCR接近,表明该传感器可以用于miRNA的检测。