胫骨软骨发育不良(Tibial Dyschondroplasia,TD)是一种常见的肉鸡营养代谢性骨骼疾病,其临床特征为骨骼畸形、站立困难、肉鸡出现跛行或瘫痪,病理特征为胫骨生长板变厚,形成无血管和低钙化的白色“软骨栓”。肉鸡TD严重影响肉鸡生产性能,降低肉鸡胴体品质,造成严重的经济损失。虽然TD的发生严重困扰全球肉鸡养殖行业的健康发展,然而其发病机制仍未阐明。本研究以福美双诱发肉鸡TD,从转录组、蛋白质组和代谢组水平系统阐明肉鸡TD发生时的内部潜在分子机制,并通过组学关联分析筛选出肉鸡TD发生时重要的调控通路及调控蛋白,为防控肉鸡TD的药物研发和品种选育提供靶标蛋白。本研究主要内容如下:1.肉鸡TD的临床与病理特征研究对TD发病肉鸡进行临床症状、病理组织学及影像学分析,充分了解TD的临床病理特征及血清相关骨代谢指标变化趋势有助于我们对肉鸡TD的临床和病理诊断,提高肉鸡TD的防治效果。本研究利用福美双诱发肉鸡TD,详细剖析了肉鸡发生TD时的胫骨病理组织学特点、胫骨参数、骨密度以及血清骨转换代谢指标的变化。结果显示TD肉鸡出现站立困难,腿部骨骼畸形和瘫痪,剖解发现TD生长板增厚明显,血管侵入显著减少并形成白色“软骨栓”,TD胫骨重量显著低于正常组,TD发病后期胫骨指数和生长板宽度系数显著高于对照组,肉鸡胫骨密度(BMD)在TD发病后第14天和第18天显著低于对照组,胫骨骨矿含量(BMC)在第18天低于正常组肉鸡,胫骨骺端HE染色显示TD肉鸡生长板增殖区有大量软骨细胞堆积和凋亡,肥大区软骨细胞核皱缩和溶解,软骨钙化区钙化紊乱,血管发育受损,血管浸润减少;此外干骺端骨小梁排列错乱、有坏死区域、血管体积和骨小梁体积显著降低。TD肉鸡血清骨转换标志物碱性磷酸酶(ALP)活性和血清骨钙素(OCN)浓度显著低于正常组肉鸡,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)的活性显著高于对照组。2.肉鸡TD生长板转录组学研究肉鸡胫骨软骨发育是一个复杂而有序,受各种转录因子和信号分子共同调控的过程。通过转录组学深入解析肉鸡TD的发病机理及不同调控因子的相互作用,有助于防治TD的药物研发和品种选育。本试验利用转录组学技术对肉鸡TD生长板进行测定分析,结果显示与正常组肉鸡相比,TD肉鸡生长板有235个基因表达显著上调,有125个基因表达显著降低。GO分析显示上调显著的生物过程(Biological Process,BP)主要为TRAIL激活的凋亡信号通路、L-丝氨酸生物合成过程、外源性凋亡信号通路,下调显著的生物过程主要为免疫反应、对外部刺激的反应和免疫系统过程等;上调显著的GO细胞组分(Cellular Component,CC)主要为细胞外区、胞外区部分、细胞外基质、细胞外间隙、胶原三聚体和含胶原蛋白的细胞外基质等,下调显著的GO细胞组分有细胞表面、质膜部分和质膜外侧等;上调显著的GO分子功能(Molecular Function,MF)主要为受体结合信号受体结合、细胞外基质结构成分、受体调节活性、胶原结合和细胞外基质成分,下调显著的GO分子功能为趋化因子受体、甘油跨膜转运蛋白活性和尿素跨膜转运蛋白活性等。KEGG分析表明DEGs主要富集于ECM受体相互作用、黏附斑粘连、TGF-β信号通路和血管生成因子VEGF信号通路等。以上结果表明TD发生时肉鸡生长板基因表达显著紊乱,且GO分析中的上调通路主要与细胞外基质(ECM)合成代谢有关,表明TD生长板中ECM合成代谢旺盛;KEGG分析中显著富集部分主要与ECM和血管生成相关,提示ECM合成代谢和血管生成因子可能在TD发病过程中起重要作用。3.肉鸡TD生长板蛋白质组学研究蛋白质组技术已经成为揭示疾病发病机理的有效手段之一,对TD肉鸡胫骨生长板进行蛋白质组学研究,了解肉鸡TD的总体蛋白表达水平,蛋白丰度及功能注释以及蛋白之间的互作关系有助于全面了解TD发病机制。本试验运用TMT蛋白质组学技术对肉鸡TD生长板进行分析,结果显示,与对照组相比,TD组共有595个蛋白差异显著表达(DEPs),其中表达上调蛋白数为391个,表达下调蛋白数为204个。对DEPs进行GO功能富集分析,显示在BP中上调蛋白主要参与细胞外基质组织、骨骼系统发育和止血负调节等,表明TD肉鸡软骨细胞外基质组织及止血调节等生物学过程显著增强。下调蛋白在BP中主要富集于核苷磷酸代谢过程、氧化磷酸化、核糖磷酸代谢过程、细胞呼吸和呼吸电子传输链等,说明TD软骨细胞的氧化磷酸化、软骨细胞呼吸及电子传递等过程受到抑制。在CC中上调蛋白主要参与软骨细胞的细胞外区、细胞外间隙、细胞外基质、内质网内腔、含胶原蛋白的细胞外基质和胶原三聚体等,说明TD软骨细胞外基质相关组分显著增强。在CC中下调蛋白主要富集于胞线粒体、线粒体内膜、细胞器内膜、呼吸链复合体IV、线粒体蛋白复合物、细胞色素复合体、线粒体膜和呼吸链复合体等说明软骨细胞线粒体结构显著受到影响,在MF中上调蛋白主要富集于糖胺聚糖结合和肝素结合,说明TD生长板细胞中细胞外基质的合成比较活跃;在MF中的下调蛋白主要涉及泛醌结合、氧化还原酶活性、质子跨膜转运蛋白活性、醌结合、电子转移活性、细胞色素c氧化酶活性等,提示TD软骨细胞的线粒体分子功能受到破坏。对DEPs进行KEGG富集、Clue GO+Clue Pedia模块化及互作网络分析以及GSEA分析,结果显示DEPs主要在ECM受体相互作用、补体和凝血级联、PI3K-Akt信号通路和黏附粘连等通路中富集显著增强,在氧化磷酸化及细胞周期等富集显著减弱。说明TD软骨细胞ECM合成代谢通路增强而软骨细胞线粒体功能和细胞周期受损。4.肉鸡TD生长板和血清代谢组学研究代谢组学已被广泛运用于各类疾病研究,运用代谢组学研究TD肉鸡与正常肉鸡的生长板及血清的代谢物差异变化,找出血清与生长板组织共有的差异代谢物(DEMs),有助于筛选出可作为TD生物标志物的小分子代谢物。同时研究差异代谢物参与TD发生时的生物学过程,有利于从小分子代谢物水平揭示肉鸡TD发病机制。本研究中,以FC>1.5或<0.67,p?immune priming析带来的数据缺失问题,且两两组学相互验证,降低单一组学的假阳性。重要的是转录组、蛋白组与代谢组关联分析能全面揭示疾病发生发展过程中的病理学机制。本研究通过转录组、蛋白组与代谢组学关联分析显示肉鸡TD生长板软骨细胞外基质降解受到抑制,同时胶原与透明质酸等细胞外基质合成增加。ELISA检STM2457临床试验测结果也进一步表明肉鸡TD生长板的细胞外基质分子(胶原、透明质酸和糖胺聚糖)含量显著增多,阿利新蓝染色和番红固绿染色也显示细胞外基质(透明质酸和糖蛋白)在肉鸡TD生长板中显著沉积,表明肉鸡TD生长板中细胞外基质合成显著增强。对DEGs、DEPs与DEMs进行整合分析发现肉鸡TD生长板软骨细胞糖酵解及三羧酸循坏等能量代谢途径降低,而己糖胺和葡萄糖醛酸途径增强导致ECM(透明质酸和胶selleck原蛋白)的合成增加,引起ECM过度沉积。此外对转录组、蛋白质组和代谢组进行KEGG通路映射分析,发现DEGs,DEPs及DEMs均共同映射到FoxO信号通路中,提示FoxO通路可能在肉鸡TD中起调控作用。6.FoxO1对肉鸡软骨细胞血管生成和ECM合成的影响前面的关联分析发现DEGs、DEPs及DEMs均映射到FoxO信号通路中,组织免疫荧光和WB检测结果也显示FoxO1及其乙酰化蛋白在肉鸡TD胫骨生长板中表达显著降低,说明FoxO信号通路可能在TD中起到重要调节作用。为了探讨FoxO1与软骨细胞血管生成和ECM之间的关系,本研究通过si RNA体外抑制软骨细胞FoxO1的表达,结果显示si-FoxO1转染软骨细胞后显著降低了血管生成因子VEGFA和血管内皮化标志蛋白CD31表达水平,提示FoxO1调控软骨细胞血管的形成。之后我们利用Ch IP技术检测了正常肉鸡和TD肉鸡生长板转录因子FoxO1与VEGFA启动子区域的结合情况。在正常组中,FoxO1显著增强了与VEGFA启动子区域的结合(p<0.05),证明了FoxO1能对VEGFA的表达进行直接调控。而在TD组中FoxO1与VEGFA启动子结合的能力显著降低且与Ig G组无差异,说明TD发生时FoxO1失去了对VEGFA表达的调控。此外,转染si-FoxO1显著下调了软骨细胞基质降解酶MMP9的表达,上调了基质降解酶抑制蛋白TIMP1的表达,同时细胞外基质主要分子Col-Ⅱ、HA和COMP的表达水平在si-FoxO1转染组中显著升高。表明FoxO1可能通过介导细胞基质降解酶MMPs和基质降解酶抑制剂TIMP的表达来间接调控软骨细胞胞外基质ECM的合成与分解。对软骨细胞进行茜素红染色,结果显示si-FoxO1转染组的钙化能力显著低于对照组和si-RNA阴性组,说明抑制FoxO1的表达显著降低软骨细胞的钙化能力。以上结果表明FoxO1在肉鸡TD软骨细胞血管生成和细胞基质降解中有显著调控作用,同时也证明了FoxO1蛋白是肉鸡TD发生过程中的重要靶标蛋白。综上所述,本研究详细分析了肉鸡TD模型中详细病理特征,并对肉鸡生长板进行转录组、蛋白质组以及代谢组学分析揭示了肉鸡TD发病时的潜在分子机制,并通过关联分析找到了潜在的肉鸡TD调控蛋白FoxO1,明确了FoxO1在软骨细胞血管生成以及ECM形成中的调控作用,证明了FoxO1可作为药物防治TD的重要靶标蛋白。