研究背景中国正面临着癌症发病率和死亡率持续上升、癌症患者数量巨大、五年生存率低的严峻现实。传统治疗方法包括手术、Apoptosis抑制剂放疗、化疗、全身辅助治疗等,虽取得一定成效,但依然存在局限性。开发癌症治疗的新药物和新技术,成为了全球科研人员的共识。光热治疗(photothermal therapy,PTT)作为一种非浸润性的肿瘤消融手段,可以有效杀伤癌细胞实现对原发肿瘤的清除。但过高的温度会对周围组织造成热损伤,也会导致有害的生物学效应。即便使用低温光热治疗(mild PTT,m PTT,42-45°C)也会激活肿瘤细胞内热休克蛋白(HSPs)的表达,导致肿瘤细胞产生热抵抗,削弱疗效。因此,抑制HSPs的表达是实现高效m PTT的关键。而纳米酶产生的活性氧物质(ROS)可与蛋白质的伯氨结构发生交联,从而直接破坏HSPs的结构和功能。纳米酶作为一种具有模拟酶活性的纳米材料,其特有的多功能催化活性使其能够在肿瘤微环境(TME)中特异性地催化产生细胞毒性分子,被广泛应用于构建肿瘤治疗策略的基础研究中。其中,类过氧化物酶(POD)活性可以催化TME中过表达的H_2O_2生成高细胞毒性的羟基自由基(·OH);类过氧化氢酶(CAT)活性可以将H_2O_2转化为O_2,不仅能有效缓解肿瘤组织的乏氧,而且能激活类氧化酶性质(OXD)催化活性;OXD活性能催化O_2生成·O_2~-,生成的·O_2~-在酸性TME条件下与H~+反应,部分转化为~1O_2。所以,通过纳米酶调节胞内ROS应激水平可降低癌细胞的热耐受性,有望改善低温光热疗效。研究目的由于纳米酶具有低成本、高稳定性、易于保存和显著的物理化学性质,同时其丰富高效的催化活性让其广泛应用于诸多领域。因此,本研究着力于设计一种基于贵金属的金-钯(Au@Pd)纳米酶,其具有类过氧化氢酶、类氧化酶和类过氧化物酶三重酶活性,通过三种酶活性在TME中利用其酸性环境及过表达的H_2O_2产生大量ROS,充分其发挥破坏HSPs功能和损伤肿瘤细胞的化学作用。更重要的是,鉴于金-钯两种贵金属具有优良的光热转换效率,本课题将Au@Pd纳米酶的模拟酶活性与光热效应相结合,以实现ROS介导增强的低温PTT,从而获得更好的肿瘤消融效果。研究方法(1)核壳结构的金-钯纳米酶的制备与表征:利用种子生长的模板法合成金纳米棒,在包覆介孔二氧化硅(m Si O_2)后利用盐酸刻蚀金纳米棒留出钯的生长空间,在抗坏血酸的还原下合成了具有介孔二氧化硅包覆的金-钯纳米酶,最后使用氢氧化钠将介孔二氧化硅外壳刻蚀干净,获得核壳结构的Au@Pd纳米酶。X射线粉末衍射仪(X-ray powder difractometer,XRD),透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)和元素分析分别确定产物的晶相,结构,形貌和元素的组成与分布。马尔文粒度仪分析纳米材料的尺寸大小,分散性与带电性质。紫外-可见吸收光谱评估材料在不同波段的光吸收能力。(2)Au@Pd纳米酶的模拟酶活性和光热效应:使用溶解氧仪检测加入H_2O_2和Au@Pd纳米酶后氧气生成的变化,验证其类过氧化氢酶(CAT)活性。利用1,3-Diphenylisobenzofuran(DPBF)、3,3’5,5’-四甲基联苯胺(TMB)和邻苯二胺(OPD)作为底物探针分别检测类氧化酶(OXD)和类过氧化物酶(POD)的活性。在波长为1064 nm的激光照射下使用红外热成像相机记录温度的实时变化,计算出Au@Pd纳米酶的光热转换效率,同时重复实验,证明Au@Pd具有较好的光热稳定性。通过ESR(Electron spin-resonance spectroscopy)检测在模拟肿瘤微环境下,Au@Pd纳米酶能催化三种活性氧物质(·OH,·O_2~-,~1O_2)的产生。(3)体外细胞实验:2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)作为探针,采用激光共聚焦显微镜检测胞内ROS水平。用DHE、HPF、SOSG探针分别检测细胞内三种活性氧水平。用MTT和活死细胞双染试剂盒(Calcein-AM/PI)来检测细胞相容性,存活率及死亡情况;用蛋白质印迹分析检测胞内HSP70的表达水平。(4)体内抑瘤实验:将4T1细胞皮下注射到鼠龄为6-8周的雌性Balb/c小鼠乳房脂肪垫构建肿瘤模型。经瘤内注射Au@Pd纳米酶后进行m PTT处genetic immunotherapy理,测量肿瘤体积和小鼠体重评估疗效,通过ROS/Hsp70组织切片染色证实纳米酶的治疗机制。主要脏器组织Y-27632体外切片经苏木精和伊红(H&E)染色和血液生化分析评估Au@Pd纳米酶的生物活体相容性。研究结果(1)Au@Pd纳米酶具有金-钯双金属,整体呈现核壳结构。通过控制刻蚀金纳米棒的时间可以控制金纳米棒的长径比,同时可以使金属钯的生长空间得到合适的调控。TEM、XRD等表征测试证实介孔二氧化硅包覆于金纳米棒表面,以及金属钯成功包覆在刻蚀后的金纳米棒上。(2)金属钯作为工业生产中广泛应用的催化剂,在TME环境中赋予了Au@Pd模拟酶的活性,丰富了单纯金纳米棒的性能。其模拟的三重酶(类CAT酶、类OXD酶和类POD酶)活性,使Au@Pd纳米酶可在TME中通过多途径大量产生ROS。(3)体外细胞实验证实,Au@Pd纳米酶具有较好的生物相容性,对小鼠L929细胞基本没有损伤,而对小鼠乳腺癌4T1细胞具有明显的浓度依赖毒性。随后用DCFH-DA、DHE、HPF和SOSG探针在激光共聚焦显微镜下分别观察到,在Au@Pd纳米酶存在下4T1细胞内ROS明显增多,加入近红外(NIR)光照条件后,ROS的含量进一步增加。同时,MTT和活死细胞染色实验结果也与上述结果相对应,说明在Au@Pd纳米酶联合光热的策略下,产生了协同的抗肿瘤效应,为后续的体内抑瘤实验奠定了基础。蛋白质印迹分析显示,在NIR激活下,Au@Pd纳米酶在TME中产生大量的ROS可以消耗热应激所表达的HSP70,显著降低肿瘤细胞热抵抗性,增强低温光热的疗效。(4)基于Au@Pd纳米酶的模拟酶活性联合NIR响应光热效应的策略能通过ROS介导的m PTT实现对原位肿瘤生长的抑制。结论本课题成功构建了近红外二区1064 nm激光响应的Au@Pd纳米酶治疗体系,基于贵金属合成的Au@Pd纳米酶在TME中具有多种类酶生物催化活性,可以实现肿瘤细胞内ROS的积累,抑制热应激状态下HSP70的表达,实现增强温和光热的疗效,在体内外实验中均显示了较好的抗肿瘤效果。