水疱性口炎(Vesicular stomatitis,VS)是一种人畜共患的急性传染病,而水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)基因组是极易变异的RNA,使得该病的防控变得困难。先天性免疫是保护机体健康的第一道屏障,其中干扰素具有广谱抗病毒的作用,浆细胞样树突状细胞(Plasma cell like dendritic cell,p DC)是产生I型干扰素的专职细胞。此外促炎细胞因子在炎症反应中也发挥重要作用。位于内体的Toll样受体7(Toll-like receptor 7,TLR7)识别病毒的单链RNA等配体后激活p DC产生大量的I型干扰素,并通过信号级联反应产生多种促炎Proton Pump抑制剂细胞因子。本试验通过敲除TLR7基因,研究其对VSV增殖的影响。再以VSV为试验材料,以构建的TLR7敲除细胞系作为工具,研究TLR716的抗病毒效果和作用靶点。结果显示TLR716抗病毒效果优于TLR701,并且初步证明TLR716是TLR7的激动剂。首先检测TLR701、TLR716对PK15、HEK293T/17细胞的毒性,发现在0-2.0μM的浓度范围内对细胞无毒性。然后检测TLR701、TLR716对VSV的半数有效抑制浓度,经计算得到二者的选择性系数,对其抗病毒效果进行初步筛选,结果显示TLR716抗病毒效果更好。利用流式细胞术检测在PK15细胞中TLR701、TLR716对VSVMolecular Biology增殖的影响。结果显示在PK15细胞中,TLR701、TLR716抑制VSV的增殖,且同一浓度下TLR716抗病毒效果更好。本试验利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PK15-TLR7~(-/-)细胞系。首先查找到猪源TLR7基因序列,利用sg RNA在线设计软件设计其sg RNA,与lenti CRISPRv2载体连接后进行慢病毒包装,嘌呤霉素筛选后利用Western blot检测基因编辑效率,选择编辑效率最高的作为多克隆细胞株。经有限稀释后得到单克隆细胞株,利用Western blot检测TLR7蛋白是否表达,并提取基因组送公司进行测序。利用显微镜观察敲除TLR7是否影响细胞形态,并且利用CCK-8试剂盒检测敲除TLR7是否影响细胞活性。结果显示成功获得PK15-TLR7~(-/-)单克隆细胞系,敲除TLR7并不影响PK15细胞形态和活力。为了检测TLR7基因敲除是否促进VSV病毒的增殖,利用Western blot、Q-PCR、流式细胞术、TCID_(50)检测在PK15、PK15-TLR7~(-/-)细胞中不同时间点VSV病毒复制情况。结果显示敲除TLR7基因后促进VSV在PK15细胞中的复制。接下来利用流式细胞术检测在PK15-TLR7~(-/-)细胞中TLR701、TLR716对VSV的增殖的影响。结果显示在PK15-TLR7~(-/-)细胞中两者均不能发挥作用。利用荧光素酶报告试验检测TLR701、TLR716对TLR7下游NF-κB靶基因启动子的激活情况,结果显示TLR716可激活TLR7下游NF-κB靶基因启动子;并利用Q-PCR检测在PK15、PK15-TLR7~(-/Berzosertib分子式-)细胞中IL-6、TNF-α、IFN-βm RNA表达水平的变化,结果显示在PK15细胞中TLR716可以在转录水平上调这些细胞因子,而在PK15-TLR7~(-/-)细胞不能发挥作用。综上所述,初步证明TLR716是TLR7的激动剂,且对VSV增殖的抑制效果优于TLR701。