选题依据:柴归颗粒(CG)是本课题组在解析经典抗抑郁复方逍遥散科学内涵基础上研发的抗抑郁新药,大量研究已经证实CG具有确切的抗抑郁作用,然而其抗抑郁机制尚未完全清晰。课题组近期通过外周血单个核细胞(PBMCs)代谢组学和转录组学研究发现,慢性不可预测温和应激(CUMS)大鼠PBMCs嘌呤代谢出现紊乱,CG有显著的改善作用,提示CG的抗抑郁作用与外周嘌呤代谢的调节有关。然而,CG对CUMS大鼠脑部嘌呤代谢是否也有相同的调控作用?CG通过调节嘌呤代谢发挥抗抑郁作用的内在机制是什么?这些问题尚不清楚。前期研究结合文献提示,嘌呤代谢途径中有多种代谢物广泛参与抑郁症的发生与发展,其中,嘌呤代谢物作用于嘌呤能受体后引起的生物学变化是嘌呤相关代谢物调控抑郁症的重要原因。经文献调研发现,嘌呤能P2X7、A_1、A_(2A)受体失调与抑郁症的发病密切相关,并且主要通过影响Nod样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体通路和环磷酸腺苷(cAMP)-蛋白激酶A(PKA)通路调控抑郁症。然而,CG是否通过调节关键的嘌呤代谢物影响嘌呤能受体及相关信号通路发挥抗抑郁作用尚不清楚。脑部前额皮层(PFC)是控制情绪与认知的关键部位,以PFC为考察对象,开展抑郁症的发病机制及抗抑郁药物的治疗机制研究具有重要意义。因此,本研究以PFC嘌呤代谢为切入点,采用超高效液相色谱串联质谱(UHPLC-MS/MS)靶向定量分析、外源增补嘌呤代谢物、引入嘌呤能受体拮抗剂等方法,深入剖析CG通过调节脑部嘌呤代谢影响嘌呤能受体及相关信号通路的抗抑郁机制,以上研究为CG临床应用的指导和抗抑郁新药的研发提供参考。目的:1.分析CG对CUMS大鼠PFC中嘌呤代谢物的影响。2.考察CG对CUMS大鼠PFC嘌呤能P2X7、A_1、A_(2A)受体及NLRP3炎症小体通路、cAMP-PKA通路的调节作用。3.明确CG通过调节关键嘌呤代谢物影响嘌呤能受体表达的抗抑郁机制。4.明确CG通过调节嘌呤能受体影响相关信号通路的抗抑郁机制。方法:1.根据前期CG抗抑郁剂量的筛选结果,设置8.3 g生药/kg为CG的给药剂量。将大鼠随机分为对照组(Control)、抑郁模型组(CUMS)和抑郁模型+柴归颗粒给药组(CUMS+CG),造模及给药28天。大鼠处死后,采用UHPLC-MS/MS靶向定量分析方法对3组大鼠PFC中11种嘌呤代谢物含量进行测定,考察CG对CUMS大鼠PFC嘌呤代谢的调节作用。2.采用Western blot测定各组大鼠PFC嘌呤能P2X7、A_1、A_(2A)受体和相关信号通路(NLRP3炎症小体通路、cAMP-PKA通路),同时,采用酶联免疫吸附测试(ELISA)检测cAMP、白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α的水平,并利用试剂盒检测丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活力,综合以上方法考察CG对CUMS大鼠PFC嘌呤能受体及相关信号通路的影响。3.采用皮质酮(CORT)损伤的PC12细胞体外模型,外源增补嘌呤代谢物,设置分组为对照组、CORT组、CORT+CG组、CORT+黄嘌呤组、CORT+腺苷组、CORT+肌苷组、CORT+黄嘌呤+CG组、CORT+腺苷+CG组、CORT+肌苷+CG组,并用免疫荧光染色技术测定嘌呤能P2X7、A_1、A_(2A)受体的表达量,考察外源性嘌呤代谢物对嘌呤能受体表达的影响及CG的调节作用,以此阐明CG通过调节嘌呤代谢物影响嘌呤能受体表达的抗抑郁机制。4.采用CORT损伤的PC12细胞模型,将P2X7、A_1、A_(2A)受体拮抗剂分别与CG共孵育,设置分组为对照组、CORT组、CORT+CG组、CORT+CG+P2X7受体拮抗剂组、CORT+CG+A_1受体拮抗剂组、CORT+CG+A_(2A)受体拮抗剂组,并用Western blot和ELISA分析各组NLRP3炎症小体通路和cAMP-PKA通路,考察嘌呤能受体拮抗剂对CG调节NLRP3炎症小体通路和cAMP-PKA通路的影响,以此阐明CG通过调节嘌呤能受体影响相关信号通路的抗抑郁机制。结果:1.UHPLC-MS/MS靶向定量分析结果表明,与正常大鼠相比,CUMS大鼠PFC嘌呤代谢下游代谢物黄嘌呤显著增加,而其它10种代谢物含量显著下降,提示CUMS大鼠PFC嘌呤代谢出现紊乱,并且黄嘌呤的过度积累是重要标志。与模型组相比,CG给药后,CUMS大鼠PFC黄嘌呤含量显著(P<0.001)回调,同时,嘌呤核苷水平代谢物(腺苷、肌苷、黄苷、鸟苷)的含量显著(P<0.001)升高,提示CG的抗抑郁作用与减少黄嘌呤和增加4种嘌呤核苷含量密切相关。2.Western blot分析结果表明,相比于正常大鼠,CUMS大鼠PFC中嘌呤能P2X7、A_(2A)受体表达量异常增加,而A_1受体表达量显著下降,CG给药后显著回调了3种嘌呤能受体的表达,提示CG的抗抑郁作用与抑制P2X7、A_(2A)受体和促进A_1受体的表达有关。此外,Western blot、ELISA和试剂盒检测结果表明,与对照组相比,CUMS大鼠PFC中NLRP3炎症小体通路NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达量和IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA水平显著升高,SOD活力显著下降,CG给药后显著回调了以上指标,同时,CUMS大鼠PFC中cAMP-PKA通路cAMP水平和PKA蛋白表达量显著下降,CG给药后显著改善了cAMP水平和PKA表达,提示CG的抗抑郁作用与抑制NLRP3炎症小体通路和激活cAMP-PKA通路有关。3.免疫荧光染色分析结果表明,相比于对照组,CORT组中P2X7、A_(2A)受体表达量显著增加,而A_1受体表达量显著下降。相比于CORT组,CORT+CG组中3种嘌呤能受体的表hepatogenic differentiation达发生显著回调,该结果与动物水平一致。此外,相比于CORT组,CORT+黄嘌呤组中P2X7受体的表达增加,但相比于CORT+黄嘌呤组,CORT+黄嘌呤+CG组中P2X7受体的表达显著下降,表明CG能抑制黄嘌呤对P2X7受体的促表达作用。同时,相比于CORT组,CORT+腺苷组和CORT+肌苷组中A_1受体的表达显著增加,而CORT+腺苷+CG组和CORT+肌苷+CG组进一步促进A_1受体的表达,表明CG能增强腺苷或肌苷对A_1受体的促表达作用。值得注意的是,本研究结果显示,外源性嘌呤代谢物对A_(2A)R的表达没有明显影响。结合动物研究结果,提示CG的抗抑郁作用与黄嘌呤购买Baf-A1-P2X7受体作用的抑制和腺苷/肌苷-A_1受体作用的促进有关。4.Western blot和ELISA结果表明,与正常PC12细胞相比,CORT损伤的PC12细胞中NLRP3炎症小体通路NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达量显著增加,cAMP-PKA通路cAMP水平和PKA蛋白表达量显著下降,在CG与CORT共孵育后,CG抑制NLRP3炎症小体通路并激活cAMP-PKA通路,该结果与动物水平一致。在P2X7、A_(2A)受体拮抗剂与CG共孵育后,CG对NLRP3炎症小体通路的抑制作用被增强,在A_1受体拮抗剂与CG共孵育后,CG对cAMP-PKA通路的激活作用被抑制。结合动物研究结果,提示CG的抗抑郁作用与抑制P2X7Captisol研究购买/A_(2A)受体-NLRP3炎症小体通路和激活A_1受体-cAMP-PKA通路有关。结论:通过考察CG调节嘌呤代谢物、嘌呤能受体及相关信号通路的内在联系,本课题阐明CG可能通过抑制CUMS大鼠PFC黄嘌呤-P2X7受体-NLRP3炎症小体通路和激活腺苷/肌苷-A_1受体-cAMP-PKA通路促进神经保护,并最终发挥抗抑郁作用。