目的:本研究以足三里、膻中、三阴交为主穴的经络辨证逆针灸作为干预手段,观察DMBA诱导的乳腺癌模型大鼠肿瘤的生长情况及其病理演变过程,以及EGFR/STAT3信号通路相关因子EGFR、STAT3、p-STAT3和细胞增殖和凋亡行为关键分子Ki67、Bcl-2、Bax以及CasAdavosertib核磁pase-3的表达情况,旨在从表皮生长因子受体EGFR/STAT3增殖与凋亡途径角度探讨经络辨证指导下的逆针灸对DMBA诱导的乳腺癌模型大鼠的干预机制,部分阐明其在乳腺癌发生过程当中的影响与作用机理。方法:选取8周龄清洁级雌性SD未孕大鼠64只,随机分为空白对照组、模型组、他莫昔芬组和逆针灸组,每组各16只。采用DMBA单次灌胃(100mg/kg)诱导性乳腺癌模型,空白对照组给予等量芝麻油灌胃。于造模后1周对治疗组进行干预,他莫昔芬组3mg/kg灌胃,每周3次,持续16周;逆针灸组针刺“足三里,膻中,三阴交”,每周3次,每次20分钟,持续16周。治疗周期结束后,所有大鼠禁食24h,测量并记录大鼠体重后麻醉,取所有实验大鼠的双侧第2对乳腺组织以及可见的乳腺肿瘤标本分为两部分:一部分放入4%多聚甲醛溶液中固定24h,用于制作病理组织切片HE染色和免疫组化分析;另一部分装入冻存管中,储存于-70℃冰箱备用。采用HE染色对大鼠乳腺组织进行组织病理学评估;应用免疫组织化学法进行CK5/6、p63检测,观察其在DMBA诱导的乳腺癌发生过程中不同病理阶段中的分布及表达水平;采用TUNEL染色法检测大鼠乳腺肿瘤细胞凋亡水平,并在高倍镜下计数阳性细胞;采用免疫组织化学法检测大鼠乳腺肿瘤组织中EGFR、STAT3、p-STAT3、Ki67、Bcl-2、Caspase-3的表达情况,并计算其阳性细胞率;采用Western blotting法检测大鼠乳腺肿瘤组织EGFR、STAT3、Bax、Bcl-2的蛋白表达水平以及STAT3的磷酸化水平。结果:1.各组大鼠体重评估至16周末实验结束时,模型组大鼠平均体重明显低于对照组大鼠平均体重(P<0.05)。他莫昔芬组及逆针灸组平均体重略高于模型组大鼠平均体重,差异没有显著性。2.各组大鼠肿瘤生长变化情况他莫昔芬和逆针灸组大鼠平均肿瘤数量较模型组大鼠明显减少(P<0.01);与模型组相比,他莫昔芬组和逆针灸组大鼠的平均肿瘤质量显著下降(P<0.01)。3.各组大鼠在DMBA诱导的乳腺癌发生过程中不同病理阶段的组织形态学变化情况HE染色以及免疫组化染色CK5/6和p63表达结果显示,DMBA诱导的乳腺癌模型大鼠肿瘤的发生发展途径为:正常→一般增生→非典型增生→原位癌→浸润性癌;将各组大鼠乳腺组织进行病理学分类,并进行多个构成比比较的卡方检验,结果提示各组间组织病理学分布具有统计学差异(P<0.05)。4.各组大鼠乳腺肿瘤组织病理学以及细胞增殖指数Ki67表达情况HE染色结果显示,在模型组的肿瘤组织中观察到肿瘤细胞的结节块,具有分散、圆形、透明的空间(筛状)或由厚纤维组织带分隔的坏死中心区域(粉刺状),表明恶性的病理学特征,他莫昔芬组和逆针灸组乳腺肿瘤组织增生导管互相贴近或形成团块,上皮层次增多,细胞为单一型,存在少数肌上皮细胞,细胞形态大小不同,染色质增加,偶见核分裂象,细胞排列紊乱,存在异型性,双层结构消失。模型组乳腺肿瘤组织中可见大量Ki67阳性表达。他莫昔芬组和逆针灸组乳腺肿瘤组织中Ki67表达阳性细胞数量明显减少。与模型组相比,他莫昔芬组和逆针灸组的Ki67阳性细胞百分率明显低于模型组(P<0.01)。5.各组大鼠乳腺肿瘤组织TUNUL染色比较模型组乳腺组织中罕见TUNEL阳性染色细胞,他莫昔芬组及逆针灸组大鼠乳腺肿瘤组织中可见散在分布的TUNEL染色阳性的凋亡细胞。高倍镜下计数TUNEL阳性染色细胞发现,与模型组相比,逆针灸(P<0.0001)及他莫昔芬组(P<0.01)乳腺组织中TUNEL阳性细胞数量显著增加。6.各组大鼠乳腺肿瘤组织细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Caspase-3表达情况免疫组织化学法检测显示,模型组乳腺肿瘤组织中可见Bcl-2大量阳性表达,阳性细胞数较多,染色较深,他莫昔芬组以及逆针灸组乳腺肿瘤组织均可见Bloop-mediated isothermal amplificationcl-2少量浅淡阳性表达。高倍镜下观察各组阳性细胞并进行评分显示,与模型组相比,逆针灸和他莫昔芬组乳腺肿瘤组织中Bcl-2阳性表达均显示降低趋势,其中逆针灸组乳腺肿瘤组织中Bcl-2阳性表达降低具有显著性差异(P<0.05);蛋白免疫印迹检测显示,与模型组相比,他莫昔芬组和逆针灸组Bax蛋白表达显著升高,Bcl-2蛋白表达虽有下降趋势,但不具有显著差异。进一步利用软件进行条带的灰度分析比较Bax/Bcl-2比值,结果显示,逆针灸组和他莫昔芬组大鼠乳腺肿瘤组织中Bax/Bcl-2比值显著高于模型组(P<0.0001);免疫组织化学法检测显示,模型组乳腺肿瘤组织可见Caspase-3少量浅淡阳性表达,他莫昔芬组以及逆针灸组乳腺肿瘤组织均可见Caspase 3大量阳性表达,阳性细胞数较多,染色较深。高倍镜下计算Caspase 3阳性细胞率发现,与模型组相比,他莫昔芬组(P<0.01)和逆针灸组(P<0.05)乳腺组织肿瘤组织Caspase-3阳性表达率均显著升高。7.各组大鼠乳腺肿瘤组织EGFR、STAT3、p-STAT3表达水平免疫组织化学法检测显示,与模型组相比,他莫昔芬组和逆针灸组乳腺肿瘤组织EGFR的阳性表达均显示降低趋势,但他莫昔芬组无显著性差异,逆针灸组EGFR的阳性表达水平降低具有显著性差异(P<0.01);同样与模型组相比,他莫昔芬(P<0.01,P<0.05)、逆针灸(P<0.001)显著降低了STAT3以及p-STAT3阳性细胞率;蛋白免疫印迹检测显示,DMBA诱导了(模型组)EGFR和STAT3的磷酸化水平的高表达,而与模型组相比,他莫昔芬(P<0.01)、逆SBE-β-CD纯度针灸(P<0.01)显著降低了EGFR的蛋白表达水平和STAT3的磷酸化水平,其中逆针灸组降低更为显著。结论:1.经络辨证指导下的逆针灸能够抑制DMBA诱导的乳腺癌大鼠乳腺肿瘤的生长,干预DMBA诱导的乳腺肿瘤演变过程,显著抑制其病理组织学进展,一定程度上延缓正常乳腺向恶性转化的这一过程。2.经络辨证指导下的逆针灸通过影响DMBA诱导的乳腺癌大鼠乳腺肿瘤组织中细胞增殖和凋亡行为关键分子Ki67、Bcl-2、Bax以及Caspase-3的表达情况,从而诱导大鼠乳腺肿瘤细胞凋亡、抑制大鼠乳腺肿瘤细胞增殖。3.经络辨证指导下的逆针灸对DMBA诱导的乳腺癌发生过程中的干预作用可能是通过调控EGFR/STAT3信号转导通路来平衡细胞增殖和凋亡而实现的。