近年来,糖尿病(Diabetes mellitus,DM)患病率不断攀升,众所周知,血糖控制欠佳给患者带来的主要危害是糖尿病并发症,包括糖尿病急性并发症和糖尿病慢性并发症,如糖尿病性肾脏病(Diabetic kidney disease,DKD),该疾病在临床诊治中常给予降糖、降压、抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统(Rein-Angiotensin-Aldosterone-System,RASS)的激活、中药制剂等治疗,有些患者临床治疗效果较差,最终不能阻止DKD发展为终末期肾病的结局,患者需背负巨大的经济重担,生活质量极速下降。基于上述情况,早期预防及控制DKD进展是内分泌科临床医生面临的巨大挑战。既往研究发现在DKD的早期阶段,不管是患者还是动物模型中均发现肾脏组织中已出现脂质沉积及其带来的肾脏损伤,但具体的代谢机制尚不明确。连接粘附分子样蛋白L(Junctional adhesion molecules L,JAML)是JAMs系列中新发现的一个因子,研究发现在DKD患者肾脏内表达显著升高,并与肾脏内脂质过度沉积和肾小球滤过率(Estimated glomerular filtration rate,e GFR)降低有关,敲除JAML可以通过激发SIRT1/AMPK通路,调节甾醇调节元件结合蛋-1(Sterol regulatory element binding protein-1,SREBP-1)及其下游的一些关键酶,从而减少足细胞内脂质沉积及肾脏损伤。白藜芦醇(Resveratrol,RSV)是一种可从多种自然植物中提取出来的天然成分,具有降糖、降脂、改善肾脏功能等作用。既往基础研究表明RSV对肾脏的调节可以通过多个通路起作用,具体可涉及细胞凋亡、氧化应激反应、内质网应激、炎症反应、细胞自噬等机制,而对导致这些反应的上游调控机制研究甚少。本研究首先观察到不同分期DKD患者脂代谢相关指标与DKD肾损伤密切相关,通过临床患者肾组织活检观察到DKD患者肾脏内存在脂质沉积及JAML/SIRT1脂质从头合成Liraglutide生产商通路的异常表达;通过动物试验平台结果显示RSV干预可降低高脂饮食喂养导致的C57BL/6J小鼠血糖及血脂的升高,改善其肾功能损伤,并可影响JAML/SIRT1脂质从头合成通路,减少其肾脏内脂质沉积;在体外研究中观察到RSV对棕榈酸(Palmitic acid,PA)诱导MPC-5足细胞内脂质成分的影响及作用机制。本研究为RSV应用于DKD,改善其肾脏内脂质沉积及损伤提供理论依据及数据支持。第一部分不同分期糖尿病性肾脏病患者脂代谢与肾损伤相关性研究目的:通过观察不同分期糖尿病性肾脏病患者脂代谢及肾损伤变化,探讨不同分期糖尿病性肾脏病患者脂代谢与肾损伤相关性及导致肾脏内脂质沉积及肾损伤的可能机制。方法:根据e GFR水平将选取的83名DKD患者分为DKD-G2组、DKD-G3组、DKD-G4组,同时选取56名2型糖尿病无并发症患者作为对照组,收集入组患者的基本信息,测定各组患者的糖化血红蛋白、血脂、尿素、血肌酐、超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)、24h尿白蛋白等;CKD-EPI公式估算e GFR;部分患者通过肾活检观察肾组织病理(HE、PAS、Masson染色)改变;免疫组化观察肾组织内脂质合成通路相关指标JAML、SIRT1、SREBP-1、Ch REBP、ADRP水平变化,同时应用Image Pro Plus 6.0软件计算黄色阳性表达的平均光密度值(IOD_(sum)/Area_(sum))并进行统计学分析。结果:1一般临床资料和生化指标比较与对照组相比,DKD各组患者随病情的加重TC、TG、LDL-C、Apo B、Lp(a)逐步升高,HDL-C、Apo A、SOD逐步下降(P<0.05)。2肾损伤相关性因素分析病程、Hb A1C、Apo B、LP(a)、TC、LDL-C、TG与e GFR负相关,HDL-C、SOD、Apo A与e GFR正相关。其中TG、LDL-C、Apo B是e GFR的独立危险因素。病程、Hb A1C、TC、TG、LDL-C、Apo B、LP(a)与24h尿白蛋白正相关,HDL-C、Apo A、SOD与24h尿白蛋白负相关。其中TG、TC、LP(a)为24h尿白蛋白的独立危险因素。3肾脏病理及免疫组化结果3.1与对照组相比,不同分期DKD患者HE染色及PAS染色肾脏内可见系膜基质增多,肾小球囊腔变窄,入球小动脉透明样变性早期,病情越重病理改变越明显。DKD-G3和DKD-G4组可见肾小球局部硬化样改变,K-W结节形成。Masson染色可见DKD-G3和DKD-G4组患者肾脏肾间质纤维化样改变。3.2与对照组相比,不同分期DKD患者肾脏内免疫组化脂质成分ADRP表达升高,其中DKD-G3和DKD-G4组升高较DKD-G2组显著(P<0.001)。3.3与对照组相比,不同分期DKD患者肾脏内免疫组化JAML、SREBP-1、Ch REBP表达显著升高,SIRT1表达显著降低,且随着DKD病情的加重,上述表达异常加重(P<0.05或0.001)。3.4 Spearman相关分析结果显示:SIRT1与e GFR正相关,JAML、SREBP-1、Ch REBP、ADRP与e GFR负相关。SIRT1与24h尿蛋白负相关,JAML、SREBP-1、Ch REBP、ADRP与24h尿蛋白正相关。小结:1.不同分期DKD患者均有程度不同的脂代谢异常,病情越严重,血脂相关异常指标越多。2.不同分期DKD患者肾脏组织内脂质沉积均增多,JAML/SIRT1脂质从头合成通路表达受损。第二部分基于JAML/SIRT1脂质从头合成途径探讨白藜芦醇对高脂诱导小鼠肾脏脂毒性的影响目的:观察RSV对高脂饮食喂养的C57BL/6J小鼠的血糖、血脂、肾功能水平、肾脏内JAML/SIRT1脂质从头合成途径、脂质沉积情况及肾脏脂毒性损伤的影响。方法:选择C57BL/6J小鼠(n=30),分为对照组(Control,n=10)和高脂组(HFD,n=20)。HFD组给予高脂饮食喂养,Control组给予常规饮食喂养,上述过程进行12周后HFD组20只小鼠再次分组,分为高脂+白藜芦醇组(HFD+RSV,n=10)和HFD组(n=10)。干预措施方面,HFD+RSV组进行RSV干预。Control组和HFD组给予同等量的溶剂对照,各组共干预6周。观察各组小鼠体重、血糖、血脂、肾功能指标变化,HE、PAS、Masson、油红O及BODIPY染色观察各组小鼠肾组织内脂质沉积及病理变化,电镜下观察各组小鼠肾小球基底膜变化。提取各组小鼠肾脏m RNA及蛋白,采用实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法和蛋白质印迹方法(Western blot)检测各组小鼠肾脏内JAML、SIRT1、SREBP-1、Ch REBP、ADRP表达。结果:1 RSV对高脂饮食喂养小鼠体重和血糖的影响经过12周高脂饮食干预后,与Control组对比,HFD组小鼠体重明显增加,IPGTT所示各时间点的血糖均明显上升。与HFD组相比,HFD+RSV组小鼠的体重明显降低,IPGTT各时间点血糖明显下降。2 RSV对高脂饮食诱导小鼠血脂、肾功能、组织病理学及脂质沉积的影响2.1与Control组比较,HFD组小鼠血脂指标:TC、TG、LDL-C水平均明显上升,而HDL-C水平明显降低;肾功能指标:BUN、SCr明显升高。HFD+RSV组小鼠TC、TG、LDL、BUN水平较HFD组均明显降低,HDL水平明显升高。2.2 HFD组小鼠HE染色肾脏组织内可见肾小球系膜基质增加,肾小囊腔变狭窄,部分肾小管细胞出现不同程度的肥大、肿胀,多发空泡形成,评估肾小管及肾小球损伤分数明显高于Control组。HFD组小鼠肾脏组织PAS糖原染色阳性表达区域较Control组增多,而在Masson染色中可见早期轻度肾脏纤维化改变。HFD+RSV组小鼠上述病理损伤改变均减轻,肾小管及肾小球损伤分数明显降低。2.3与HFD组相比,HFD+RSV组小鼠肾组织油红O染色及BODIPY脂质荧光染色阳性表达区域明显减少。2.4在电镜下观察,HFD+RSV组小鼠肾小球基底膜厚度较HFD组明显减低,足突融合明显减轻。3 RSV对高脂饮食诱导小鼠肾脏脂质合成通路的影响与HFD组相比,HFD+RSV组小鼠肾脏组织内JAML、SREBP-1、Ch REBP、ADRP表达明显降低,SIRT1表达明显升高。小结:1.高脂喂养C57BL/6J小鼠12周,血糖、血脂、尿素氮及血肌酐水平升高,白藜芦醇干预治疗6周可显著降低上述异常指标。2.RSV干预治疗6周可改善C57BL/6J小鼠高脂饮食诱导的肾脏JAML/SIRT1脂质从头合成通路的异常表达,减少肾脏内脂质沉积及损伤。第三部分通过调控JAML表达探讨白藜芦醇改善棕榈酸诱导MPC-5足细胞内脂质沉积的作用及机制目的:通过沉默或过表达JAML,探讨RSV是否可通过部分调控JAML,激活SIRT1,抑制SREBP-1、Ch REBP表达,从而改善PA诱导的MPC-5足细胞内脂质沉积。方法:1.应用CCK-8细胞毒性试验选出PA及白藜芦醇对MPC-5足细胞的最佳干预浓度。将MPC-5足细胞分为4组,分别是:Control组(对照组)、PA组(给予PA干预24 h,PA浓度为200μM)、PA+RSV 10组(PA浓度200μM干预24h后再给予RSChemical-defined mediumV浓度10μM干预24 h)、PA+RSV 20组(PA浓度200μM干预24h后再给予RSV浓度20μM干预24 h)。分组干预结束后检测各组MPC-5细胞内的TG含量,同时进行油红O和BODIPY染色,观察细胞内脂质成分,免疫荧光定位染色观察各组细胞内JAML的表达情况,RT-PCR和Western blot观察各组JAML、SIRT1、SREBP-1、Ch REBP、ADRP的表达。2.使用si RNA技术,敲低JAML表达,将MPC-5足细胞分为4组:Control组(对照组)、PA组(PA 200μM干预24 h)、PA+si RNA-NC组(转染空白si RNA 24 h后加入PA 200μM干预24 h)、PA+si RNA-JAML组(转染JAML si RNA 24 h加入PA 200μM干预24 h)。分组干预后RT-PCR和Western blot检测,步骤同前。3.使用过表达质粒的转染技术,将JAML表达上调,将MPC-5足细胞分为4组:Control组(对照组)、Control+PI-NC组(空白质粒转染24 h)、PI-JAML组(转染JAML过表达质粒24 h)、RSV+PI-JAML组(JAML过表达质粒转染24 h后加入RSV 20μM干预24 h)。分组干预后RT-PCR和Western blot检测,步骤同前。结果:1不同浓度的PA和RSV对MPC-5足细胞存活率的影响CCK-8细胞毒性实验结果显示:PA的最佳孵育浓度为200μM,白藜芦醇的最佳干预浓度为10μM、20μM,因此选择上述浓度进行后续实验。2 RSV对PA诱导MPC-5足细胞脂质沉积的影响与PA组相比,PA+RSV 10组和PA+RSV 20组MPC-5足细胞内油红O染色及BODIPY染色均显示为细胞内脂质成分阳性表达明显减少,其中PA+RSV 20组细胞内脂滴减少优于PA+RSV 10组。3 RSV干预对PA诱导MPC-5足细胞内TG水平的影响与PA组相比,PA+RSV 10组和PA+RSV 20组MPC-5足细胞内TG含量明显下降,其中PA+RSV 20组优于PA+RSV 10组。4 RSV对PA诱导MPC-5足细胞内JAML/SIRT1脂质从头合成通路的影响4.1与对照组相比,免疫荧光定位染色观察MPC-5足细胞在PA孵育下JAML表达明显增加,表达主要位于MPC-5足细胞胞浆中,而RSV干预24 h后细胞内JAML表达明显减少。4.2与PA组相比,两种不同RSV干预浓度的PA+RSV 10组和PA+RSV20组MPC-5足细胞内JAML、SREBP-1、Ch REBP、ADRP的蛋白及m RNA表达显著降低,SIRT1表达水平明显升高。5沉默MPC-5足细胞的JAML对PA诱导的SIRT1、SREBP-1、Ch REBP、ADRP表达的影响与PA组相比,PA+si RNA-JAML组细胞内SREBP-1、Ch REBP、ADRP的蛋白及m RNA表达明显下降,SIRT1表达明显增高。6转染过表达JAML质粒后观察RSV对JAML及其下游的SIRT1、SREBP-1、Ch REBP及ADRP的影响与Control组相比,PI-JAML组MPC-5足细胞内JAML、SREBP-1、Ch REBP、ADRP表达明显升高,SIRT1表达明显下MAPK抑制剂降。与PI-JAML组相比,RSV+PI-JAML组MPC-5足细胞内JAML、SREBP-1、Ch REBP、ADRP蛋白及m RNA表达明显下降,SIRT1表达明显升高。小结:RSV可通过部分调控JAML/SIRT1介导的SREBP-1、Ch REBP脂质从头合成通路改善PA诱导的MPC-5足细胞内脂质沉积。结论:1.脂代谢紊乱与DKD肾损伤密切相关,肾脏内脂质沉积越多DKD病情越严重。DKD肾脏内存在JAML/SIRT1脂质合成通路相关蛋白的异常表达。2.RSV干预可缓解高脂喂养小鼠的体重、血糖、血脂及尿素氮水平,改善肾脏内脂质沉积,减轻糖尿病性肾损伤。通过调节JAML/SIRT1通路的蛋白和m RNA的表达是其机制之一。