鸡传染性支气管炎病毒(IBV)属于冠状病毒科γ冠状病毒,单股正链RNA病毒。IBV引起的传染性支气管炎(IB)自1931年被发现以来,在世界范围内广泛传播,对养殖企业造成了严重危害。疫苗的使用一定程度上控制了 social medicineIB的发展传播,使目前该病处于多地散发的情况,但其防控形势依然不容乐观。鉴于疫苗免疫是目前防控IBV的主要策略,因此建立广谱的能用于评价不同血清型疫苗免疫效果的免疫学技术尤为重要。同时,目前一些商品化疫苗对不同血清型IBV的保护效果较为有限,开发广谱新型IBV疫苗迫在眉睫。本研究通过分析IBV纤突蛋白(Spike,S)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N)的保守序列,分别建立了基于保守表位的检测S蛋白抗体的多肽ELISA以及检测N蛋白抗体的N2-ELISA,并研制了针对IBV N蛋白的广谱性单克隆抗体;利用CRISPR/cas9技术构建了表达IBV广谱多表位的重组血清4型禽腺病毒(FAdV-4)FAV4-EX1和FAV4-EX2,并通过攻毒保护试验探究了重组FAdV-4病毒对FAdV-4和IBV的保护效果。1.基于S2蛋白保守多肽的检测IBV抗体ELISA方法的建立利用生物软件对不同IBV毒株的S蛋白进行分析,发现并合成了位于S2上的一段保守抗原肽(P2:CQANYVSVNKTVITTFVDNDDFDFDDELSKWWNDTKHELPD FDDFNYTVP),并以此作为包被抗原,通过对抗原包被浓度、血清稀释度、抗体稀释液、一抗孵育时间、二抗稀释浓度等条件进行了摸索,最终建立了基于保守抗原肽(P2)的检测IBV特异性抗体的pELISA方法。pELISA方法在检测不同血清型的IBV(QX、TW、GVI、4/91和H120)抗体时显示出良好的特异性和灵敏度,而对所检测的其他病原的抗体不反应。通过半对数回归方程初步建立了 pELISA结果(S/P值)与血清样本终点抗体滴度之间的关系(log10(titer)=(2.823-S/P)/7.045),pELISA预测的抗体滴度与IFA评估的抗体滴度基本一致。此外,pELISA和商品化IDEXX ELISA之间的符合率为96.07%。所有这些数据表明,该pELISA可以作为一种快速可靠的血清学检测方法,用于监测鸡群的IBV免疫或感染情况。2.基于N蛋白保守序列的IBV抗体ELISA方法的建立和抗N蛋白单抗的制备通过分析不同基因型的IBV毒株的N基因,将N蛋白上保守度较高的优势抗原区域序列 N1(1-90aa)、N2(120-265aa)及N3(305-409aa)克隆并构建至 pET-28a(+)载体上,然后利用原核表达系统对优势抗原序列进行大量表达和纯化,比较纯化的融合蛋白His-N1、His-N2和His-N3与不同血清型的IBV抗体的反应性,最后选择反应性最广谱的His-N2(120-265aa)蛋白建立了检测IBV抗体的ELISA方法(N2-ELISA),该方法能有效检测IBV感染及免疫鸡群中的抗体,且不与其他病原的抗体发生反应。同时,以N蛋白保守序列(120-265aa)的原核表达产物His-N2作为免疫原,研制出了与不同血清型的IBV(QX、TW、GVI、4/91和H120)均有交叉反应的广谱单克隆抗体,该抗体识别的表位为N蛋白240DQVFGPRTKCK250,抗IBVN蛋白单抗的制备为建立广谱灵敏的IBV抗原检测方法奠定了基础。3.表达IBV多表位的重组FAdV-4的构建及其免疫效果评价以课题组已有的EGFP与Fiber-2融合表达的FAdV-4重组病毒FA4-EGFP为模板,利用CRISPR/Cas9技术将串联的IBV广谱多表位(EX1包含中和表位H120、4/91、H120和QX毒株的S蛋白1https://www.selleck.cn/products/gsk-2894631a.html9-69aa,以及QX毒株的S蛋白上的T细胞表位403-421和 532-537aa,N 蛋白上 261-280aa、380-400aa;EX2 包含 QX 毒株的 S 蛋白 19-69aa、132-149aa、291-388aa和546-567aa,以及与EX1相同的T细胞表位)的表达盒替换Fiber-2,成功构建并纯化了重组病毒FAV4-EX1和FAV4-EX2。体外病毒生长曲线测定表明,重组病毒FAV4-EX1和FAV4-EX2在LMH细胞中均能稳定复制,但因缺失Fiber-2而复制能力稍弱于野生型FAdV-4。两株重组病毒接种14日PEG300供应商龄雏鸡后,可有效产生针对FAdV-4和IBV的中和抗体,且能在21天后抵抗FAdV-4强毒攻击。但在IBV的攻毒保护实验中发现,接种了重组病毒的鸡不仅不能抵抗IBVQX强毒攻击,甚至出现了更高的死亡率。将重组病毒接种21天的鸡血清与IBV病毒混合后接种CEK细胞后,发现该血清能明显促进IBV的复制。这些提示插入表位S蛋白上第19-69位氨基酸产生的抗体能引起ADE效应。虽然本研究研制的重组病毒不能对IBV提供有效保护,但为FAdV-4与IBV重组二联疫苗的构建提供了新思路。