秦川牛作为中国优良地方黄牛品种之一,具有耐粗饲、肉质优良等优点,属于大型肉役兼用牛,现主要作为肉用。但存在生长慢、产肉率低等缺点。虽然经过传统的杂交改良技术已经有所改进,但改良进展十分缓慢。肌肉的产量和质量是肉用型黄牛的重要经济性状,背最长肌是典型的骨骼肌,也是畜牧业中高档牛肉的来源,背最长肌是研究肉类生产性状的最佳材料。骨骼肌是一种复杂的异质性组织,表征其细胞异质性以及转录和表观遗传特征对于了解其发育的细节非常重要。本研究选择秦川牛背最长肌作为牛骨骼肌发育的研究对象,以期加深对牛骨骼肌发生过程的认识,为骨骼肌发育的相关研究提供参考,为牛的精准育种提供理论基础和技术支撑。本研究应用scRNA-seq和sc ATAC-seq分析了牛骨骼肌在胚胎期、哺乳期和成年期的细胞类型、分子特征、转录和表观遗传调控以及发育轨迹。基于详细的分子分析解析细胞异质性,推断了肌源性细胞的分化轨迹,揭示了它们的动态基因表达谱。进行SCENIC分析以证明细胞命运决定过程中的关键调控因子。通过RNA速率分析探索了这些异质细胞的未来表达状态,并使用Cell Chat工具包发现了细胞间通讯的广泛网络。此外,单细胞转录组学和染色质可及性模式被证实是高度一致的,染色质可及性和基因表达的综合分析揭示了在肌肉发生过程中起作用的关键转录调节因子。本研究的主要结果如下:1.牛胚胎期、哺乳期和成年期骨骼肌细胞异质性的鉴定利用scRNA-seq技术对牛胚胎期、哺乳期和成年期的骨骼肌细胞进行转录组分析,通过聚类分析将牛骨骼肌细胞分为29个类群,鉴定出18种细胞类型,如脂肪细胞、成肌细胞和肌细胞等,以及8个骨骼肌肌源性亚群,包括成肌细胞、肌细胞、肌源性祖细胞、I型纤维1、I型纤维2、IIA型纤维1、IIA型纤维2和IIX型纤维。检测到细胞组分在不同发育阶段之间的显著变化,在确认细节胚胎期,成纤维细胞占比最多;在哺乳期,内皮细胞占比最多,其次是IIX型肌纤维;在成年期,IIX型肌纤维占比最多。2.牛胚胎期、哺乳期和成年期骨骼肌单细胞转录组图谱的构建骨骼肌肌源性亚群的拟时序轨迹表现出明显的顺序性,根据它们的表达模式观察到8个不同的基因簇,这1493个基因的表达模式表明,有些基因的表达在拟时序内呈单调趋势,有些则表现出非单调行为。例如,基因簇1中的大多数基因如TPM3、TNNT1、MYH7、CSRP3、MUSTN1和NMRK2在拟时序内呈单调递增的表达,基因簇2、4、5、6和8中的MEGF10、SORCS3、IGFBP6、HMCN2和SASH1呈高水平的非单调基因表达趋势。通过KEGG富集分析,发现骨骼肌肌源性亚群在拟时序内的8个不同基因簇,主要受钙信号通路、PI3K-Akt信号通路和Fox O信号通路等调节。应用RNA速率分析探索了细胞未来可能的转录状态和邻近细胞之间分化的发育动态,发现II型纤维是成年牛的大多数细胞的主体,I型纤维2的RNA速率向量指向IIA型纤维1,IIA型纤维1和IIA型纤维2的RNA速率矢量指向IIX型纤维,构建了牛骨骼肌单细胞转录图谱。应用SCENIC调控推断分析了与肌肉发育相关的特异性转录调控因子,预测了MSC、MYF5、MYOD1、FOXP3、ESRRA、BACH1、SIX2和ATF4可能分别积极调控肌源性祖细胞、成肌细胞、肌细胞、I型纤维1、I型纤维2、IIA型纤维1、IIA型纤维2和IIX型纤维的转录。利用Cell Chat对scRNA-seq数据集进行分析,在这些细胞簇中分类出许多配体-受体对,进一步将其分类为重要的信号通路,包括BMP、IGF、WNT、MSTN、ANGPTL、TGFB、TNF、VEGF和FGF。3.牛胚胎期、哺乳期和成年期骨骼肌单细胞染色质可及性图谱的构建利用sc ATAC-seq技术对牛胚胎期、哺乳期和成年期的骨骼肌细胞进行染色质可及性分析,通过聚类分析鉴定出11种细胞类型,如脂肪细胞、内皮细胞、淋巴细胞、成肌细胞和IIX型纤维等,以及5个骨骼肌肌源性亚群,包括成肌细胞、肌细胞、I型纤维1、IIA型纤维1和IIX型纤维。检测到细胞组分在不同发育阶段之间的显著变化,在胚胎期,成纤维细胞占比最多;在哺乳期和成年期,IIX型肌纤维占比最多。通过评估在拟时序内的肌源性基因表达趋势,轨迹推断与scRNA-seq数据高度一致。在拟时序的最后阶段没有PAX7、ACTC1和MYF5的表达,在拟时序内没有检测到MYOD1的表达。揭示了5个肌源性亚群的可及性动态,构建了牛骨骼此网站肌单细胞染色质可及性图谱。通过motifs富集分析,预测了11种细胞类型已知和新的转录因子,揭示了一系列特异性表达的转录因子,如MYF5、MYOG、SIX2、TCF12、ZBTB18和FOSL2等。4.scRNA-seq和sc ATAC-seq的联合分析将scRNA-seq和sc ATAC-seq结果成功整合,证实了两种模式在细胞异质性、基因表达模式上高度一致。发现了3个显著表达的交集基因EPHA3、NES和ENSBTAG00000054182以及显著共享的转录因子,如MYOG、SIX2、MEF2C、MEF2D、MITF、TEAD4和ESRRB,它们可能是促进牛骨骼肌发育过程中细胞命运转变的候选因子。利用免疫组化验证了PAX7、ACTC1、MYH1、MYOG和COL3Agenetic background1等在牛骨骼肌不同发育阶段的差异表达,以及转录因子SIX2、FOXP3、ATF4、POLE3、RCOR1、HLF和WT1等的特异转录调控。通过RT-q PCR进一步证实了测序分析结果的真实性。综上,本研究基于scRNA-seq和sc ATAC-seq构建了正常牛骨骼肌发育的单细胞动态染色质/转录图谱,为了解哺乳动物骨骼肌的结构和功能及其发育过程提供了新的见解,为牛的育种研究提供了有力的理论和技术支持,将助推牛产业的发展。