单核细胞增生李斯特氏菌是一种食源性病原体,会引起细菌性食源性疾病,广泛存在于多种食物中。这种病原体的感染可能导致败血症、胃肠炎、脑膜炎,甚至会造成流产,严重时会危及生命。因此,开发一种快速高效检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法具有重要的现实意义。本研究将跨越式滚环等温扩增(Saltatory rolling circle amplification,SRCA)技术和切刻内切酶介导扩增(Nicking enzyme mediated amplification,NEMA)结合,通过G-四链体实现了单核细胞增生李斯特氏菌的高灵敏可视化检测,进一步将该方法(SRCA-NEMA-G-四链体)与电化学生物传感器结合,实现了单核细胞增生李斯特氏菌的定量检测,可满足不同条件实验室对检测的实际需求。主要研究内容与研究结果如下:(一)通过Genbank比对分析hlyA基因的保守性较高,选择hlyA基因作为靶基因检测单核细胞增生李斯特氏菌。选择含有Nb.BsmI切刻内切酶特异性切刻位点的目的序列,设计并筛选SRCA扩增引物,建立SRCA-NEMA扩增体系。同时设计茎部富含鸟嘌呤的发夹DNA(Hairpin DNA,hpDNA),且其环部与SRCA-NEMA扩增反应的部分扩增子互补。首先通过SRCA反应扩增出大量串联重复的含有切刻位点的双链 DNA(Double-stranded DNA,dsDNA),SRCA 产物可以被 Nb.BsmI切刻内切酶特异性识别并切割,且在Bst DNA聚合酶的作用下进行SRCA-NEMA扩增,生成大量单链DNA(Single-stselleck CP-690550randed DNA,ssDNA),其与hpDNA的环部互补结合,从而打开发夹结构,其部分暴露序列在Hemin和K+的作用下形成G-四链体,加入2,2’-联氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)和H2O2后,在G-四链体的作用下ABTS产生肉眼可以观察到的颜色变化,阳性结果为深绿色。在此基础上,通过对反应温度、Bst DNA聚合酶与Nb.BsmI切刻内切酶的比例、切割时间等因素的优化建立了单核细胞增生李斯特氏菌的SRCA-NEMA-G-四链体可视化检测方法,并对其进行评价,试验结果表明:在最优反应体系下,对不同浓度的单核细胞增生李斯特氏菌基因组DNA进行检测,基因组DNA的可视化检出限为5.4 fg/μL;对不同浓度的单核细胞增生李斯特氏菌纯培养物进行检测,纯培养物的可视化检出限为8 CFU/mL。在特异性试验中,只有10株单核细胞增生李斯特氏菌有明显的颜色变化(深绿色),为阳性反应结果;20株非单核细胞增生李斯特氏菌颜色无明显变化,为阴性反应结果,说明了构建的可视化方法具有良好的特异性。(二)在建立的SRCA-NEMA-G-四链体检测方法的基础上,与电化学生物传感器结合,进一步提高检测的灵敏度,建立单核细胞增生李斯特氏菌的定量检测方法。将巯基修饰的发夹DNA(HS-hpDNA)通过Au-S键固定在修饰金纳米粒子(Gold nanoparticles,AuNPs)的电极表面,并以G-四链体作为信号分子,构建基于SRCA-NEMA-G-四链体反应的电化学生物传感器检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法。利用所构建的传感器对单核细胞增生李斯特氏菌进行定量检测,并对其进行评价,试验结果表明:在最优反应体系下,对不同浓度的单核细胞增生李斯特氏菌基因组DNA进行检测,基因组DNA检出限计算为2.13 fg/μL;对不同浓度的单核细胞增生李斯特氏菌纯培养物进行检测,纯培养物检出限计算为3 CFU/mL。在特异性试验中,只有10株单核细胞增生李斯特氏菌有明显的电流信号变化,为阳性反应结果Hepatoprotective activities;20株非单核细胞增生李斯特氏菌的电流信号无明显变化,为阴性反应结果,说明了构建的电化学生物传感器特异性良好。在电化学生物传感器重复性试验中,6根电极表现出稳定的信号输出,相对标准偏差(Relative standard deviation,RSD)为3.37%。在电化学生物传感器稳定性试验中,将工作电极置于4℃保存14天,并分别在第1、3、5、7、14天取出完成后续测试,电流信号分别保持第一天初始值的97.7%、96.5%、94.7%和91.0%,结果表明电化学生物传感器具有良好的稳定性。(三selleckchem)采用本论文构建的可视化方法和电化学生物传感器对50份实际样品进行检测,并与 GB 4789.30-2016 和实时荧光定量 PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)进行了比较,试验结果显示:可视化方法和电化学生物传感器的相对敏感性皆为100%,相对特异性皆为97.8%,符合率皆为98%。基于SRCA-NEMA-G-四链体的电化学生物传感器的回收率为91.4%-111.1%,相对标准偏差为2.1%-3.2%。因此,本研究构建的电化学生物传感器较准确可靠,具有较好的实际应用价值。综上所述,本论文基于SRCA-NEMA-G-四链体建立的检测单核细胞增生李斯特氏菌的可视化方法和电化学生物传感器,具有灵敏度高、特异性强等优点。同时用G-四链体代替常用的二茂铁(Fc)信号分子大大降低了检测成本。该方法可以使用肉眼观察到的颜色变化进行定性检测,也可使用电流的信号变化进行定量检测,可视化定性检测更适用于条件相对落后的实验室或资源相对匮乏的基层检测机构,定量检测方法可应用于条件相对较好的实验室或检测机构。本研究为单核细胞增生李斯特氏菌的检测提供了新途径,也为快速检测其他食源性致病菌提供了新思路,对保障食品和公共卫生安全具有促进作用。