生物来源有机小分子和无机金属离子可以通过调节细胞的化学微环境实现对细胞命运的调控,由于其来源丰富、成本低廉,在细胞治疗与组织修复方面具有重要的应用前景。但一些脂溶性有机分子和金属离子存在溶解度差和难入胞selleckchem等问题,当它们在体外应用于细胞命运的调控时,即使可以通过增加这些材料使用浓度的方式实现对细胞的作用,但它们的材料利用度依旧非常低。当把有机小分子和金属离子以分散液的形式注射进体内调控细胞微环境时,通常也会由于注射液的扩散而导致目标部位的材料浓度迅速降低,同时还可能会对非目标细胞和组织产生副作用。因此,可以将功能小分子与金属离子通过键连接实现固态化,利用纳米化方法制备成小分子-金属纳米颗粒,并通过细胞对纳米颗粒的内吞作用以及纳米颗粒在溶酶体酸性pH微环境作用下的可控释放,实现功能小分子与金属离子对细胞内微环境和细胞命运的调控作用。这种基于细胞的内吞作用以及材料对胞内微环境响应的方式,可以使得小分子和金属离子局域、快速、定量的调控细胞,对于包括干细胞、免疫细胞、肿瘤细胞等在内的可以内吞纳米材料的细胞的命运调控具有普适性,在细胞命运调控相关的组织修复和免疫调节等领域具有重要应用前景。因此,可以根据生物来源有机小分子和无机金属离子的功能,设计出更有针对性的、更高效的、更可控的纳米材料,从而实现细胞命运的精准调控。在众多的疾病中,骨缺损相关疾病和神经退行性疾病分别是日常生活中最常见和最难治愈的疾病之一,随着再生医学的发展,利用细胞层面的组织修复进行相关疾病的治疗进步迅速,并受到越来越多的关注。作为组织修复的核心,种子细胞被广泛用于再生医学的各个领域,对于种子细胞命运的调控是实现修复和再生的关键步骤。其中,干细胞以其优异的增殖能力和多向分化的潜能常被用做骨组织和神经组织修复中的种子细胞。因此,探索可以调控干细胞定向分化的功能小分子-金属纳米颗粒在各个组织修复和相关疾病的治疗中意义重大。此外,在组织损伤后,巨噬细胞作为体内的免疫细胞之一,会引起机宿主的炎症响应,与此同时,宿主的炎症响应会影响基于干细胞的组织修复,这种影响在组织修复的起始、维持和消散阶段都起着关键作用,因此,为了更高效的实现基于干细胞的组织修复和相关疾病的治疗,功能小分子-金属纳米颗粒在调控干细胞定向分化的同时,也应调控巨噬细胞的表型和功能。针对以上问题,在本论文中,作者选择具有多重功能的神经酸和钙离子构建了神经酸钙纳米颗粒,并探究了将神经酸和钙离子的功能集于一体的神经酸钙纳米颗粒在干细胞和巨噬细胞命运调控中的作用。本论文的主要研究内容如下:(1)神经酸钙纳米颗粒的成骨-免疫多功能调控作用促进骨组织再生通过纳米沉淀法利用神经酸和醋酸钙制备了神经酸钙纳米颗粒,并利用扫描电子显微镜(SEM)、红外光谱分析仪(FTIR)、电子探针X射线显微分析仪(EPMA)、X射线衍射仪(XRD)等仪器对纳米颗粒的尺寸和结构等进行了表征。实验证明,神经酸钙纳米颗粒在被细胞内吞之后,会在pH=5.5的溶酶体的酸性环境中分解,从而实现了神经酸分子和钙离子的胞内释放。在体外,将神经酸钙纳米颗粒和间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)共培养,用实时荧光定量PCR(qPCR)、蛋白印迹法(Western blot)和免疫荧光染色(IF)等技术表征了 MSCs的成骨分化水平,体外实验表明,在神经酸钙纳米颗粒的介导下,干细胞中成骨相关基因和蛋白的表达均得到提高,如OPN和OCN,并且胞内的钙沉积增多,这说明神经酸钙纳米颗粒促进了 MSCs向成骨细胞分化。由于骨损伤之后,大量的炎性细胞如促炎的M1型巨噬细胞会浸润损伤部位,剧烈的炎症响应会导致纤维组织的形成和生物材料的失效,不利于骨修复,因此,作者继续研究了神经酸钙纳米颗粒对巨噬细胞的影响。将神经酸钙纳米颗粒和巨噬细胞共培养,使用qPCR、Western blot和IF等手段表征了巨噬细胞的极化状态,试验结果表明,和巨噬细胞M1极化相关的基因和蛋白的表达均得到抑制,如iNOS和COX2,这说明神经酸钙纳米颗粒可以抑制巨噬细胞M1极化和抑制炎症因子的表达。通过将神经酸和醋酸钙用于MSCs和巨噬细胞的培养,作者发现,神经酸可以抑制巨噬细胞M1极化,醋酸钙可以促进MSCs成骨分化,因此,神经酸钙纳米颗粒的促干细胞成骨分化的功能和调控巨噬细胞极化的功能分别来源于胞内释放的钙离子和神经酸,这是其特有的作用机制。在动物体内,和对照组、神经酸组以及醋酸钙组相比,神经酸钙纳米颗粒促进大鼠颅骨缺损处骨再生的效果最为显著,这说明将抗炎功能和成骨诱导功能相结合的神经酸钙纳米颗粒更有助于骨再生。作者用一种高安全且低成本的方式将钙离子和神经酸整合在一起,通过纳米化制成固相多功能纳米材料,材料生物相容性良好且可降解,可以作为骨诱导制剂和免疫调节制剂高效地促进骨缺损处的骨再生,在治疗骨缺损相关的疾病方面有很好的应用前景。(2)神经酸钙纳米颗粒的神经诱导功能促进神经干细胞分化干细胞疗法被认为是细胞介导治疗神经退行性疾病的潜在方法。在各种干细胞中,神经干细胞(neural stem cells,NSCs)具有高度的自我更新能力,而且可以分化为神经元和神经胶质细胞,在神经退行性疾病的治疗中拥有巨大潜力。调控NSCs向神经元分化成为了神经退行性疾病和神经组织工程的重要研究方向。基于神经酸和钙离子的神经保护作用以及促进神经元分化作用,作者探索了神经酸钙纳米颗粒对NSCs命运的调控作用。将神经酸钙纳米颗粒和NSCs共培养之后,使用qPCR和IF等方法表征了 NSCs的神经分化水平,qPCR结果表明,神经酸钙纳米颗粒促进了 NSCs中神经元标志物TUJ1和MAP2的mRNA的表达,IF的结果表明,在神经酸钙纳米颗粒的介导下,这两种标志物蛋白的表达水平也均得到提高,这说明神经酸钙纳米颗粒促进了 NSCs向神经元分化。材料溶酶diABZI STING agonist作用体共定位实验表明,神经酸钙纳米颗粒被细胞内吞后会进入溶酶体中,由于此纳米颗粒具有溶酶体pH(pH≈5.5)智能响应的特性,神经酸和钙离子随即被释放到细胞内,基于神经酸和钙离子的神经保护功能以及促进神经元分化功能,实现神经元的再生。这一多功能纳米药物为用于神经退行性疾病治疗的智能纳米材料的设计提供了新思路,为神经组织修复和再生临床应用提供了新平台。综上所述,本论文致力于探索有机功能小分子和金属离子在细胞命运调控和组织修复中的应用方式,通过将有机小分子和金属离子纳米化,实现材料的胞内递送,并利用纳米颗粒对细胞内源微环境响应的特性,实现功能小分子和金属离子的胞内释放,从而对细胞微环境和细胞命运起到调控作用。之后,为寻求更有效的治疗骨缺损相关疾病和神经退行性疾病的方法,以神经酸钙纳米颗粒为例,研究其对MSCs、NSCs以及巨噬细胞命运调控和组织修复中的作用,该材料生物相容性良好,能够Hepatosplenic T-cell lymphoma调控干细胞和免疫细胞的命运,为细胞命运的调控提供了新的思路和方法,并且为组织损伤相关疾病和炎症等疾病的治疗提供一种纳米化和局域化的新型治疗策略,有很好的临床应用前景。