木质纤维素是自然界中最丰富的碳源,通过纤维素酶系的协同作用降解为可发酵糖而被循环利用。多数内切纤维素酶含有多个功能模块,即模块型纤维素酶。目前对不同模块的功能已经有初步了解,但是对各模块间的分子内协同作用机制还缺乏清晰的了解。因此,探究模块型纤维素酶与底物的相互作用,对阐明多模块内切纤维素酶的分子内协同机制具有重要意义。本论文以来自解纤维嗜热酸菌Acidothermus cellulolyticus 11B的两个GH9家族多模块内切纤维素酶Ac Cel9A和Ac Cel9B为研究对象,开展突变体的构建纯化及与底物的互作研究。Ac Cel9A从N端到C端包括CD,CBM3和CBM2三个结构域;而Ac Cel9B除N端的信号肽(38 a.a)外,从N到C端含有1个CGefitinib采购D,2个CBM3,1个FN3和1个CBM2等五个结构域。为了探究多模块内切纤维素酶GH9家族与不同底物的相互作用机制,本文开展以下研究:(1)对Ac Cel9B野生型及结构域缺失突变体进行了表达纯化,酶学性质表征。结果表明,与对照组相比,Ac Cel9B-(CBM3)_2+FN3以RAC+Lignin为底物反应时,酶活力下降幅度最小,仅降低7.6%,说明FN3模块受到木质素影响最小;差示扫描量热分析表明,Ac Cel9B-(CBM3)_2+FN3的T_m值最高,为66.33℃,说明FN3模块能够提高酶的热稳定性。上述结果表明FN3模块对酶活性、稳定性等具有重要作用,同时可能促使酶抵抗底物中木质素的非特异结合,从而降低木质素对酶活性的负面影响。(2)通过酶与不同底物的吸附、解吸附和吸附动力学等测定,探讨了酶与底物的相互作用。饱和吸附研究发现Ac Cel9B及其突变体以RAC为底物时最大吸附量为51.89μmol/g～54.37μmol/g;Ac Cel9B-(CBM3)_2+FN3的吸附量高于Ac Cel9B,说明CBM2模块不利于酶与底物RAC的吸附;Ac Cel9B及其突变体以Avicel为底物时最大吸附量为45.48μmol/g～51.25μmol/g,且吸附量与结构域的数量呈正相关。为了阐明产生上述结果的原因,对Ac Cel9B及其突变体进行吸附动力学测定,以RAC为底物时,可以拟合出良好的准一级、二级吸附动力学曲线,以Avicel为底物时,仅能拟合得到准一级吸附动力学曲线,说明酶与RAC以简单的化学作用力为主,与Avicel相互作用过程复杂。上述结果表明Ac Cel9B及其突变体更容易与RAC结合,并且结构域类型及数量分别影响了酶与底物的相互作用。(3)为了阐明各功能模块的分子内协同机制,以模块构成简单的Ac Cel9A为研究对象,对模块之间linker的PT-box序列进行重构,构建并表达纯化突变体Ac Cel9A-PT0和Ac Cel9A-PT1。酶学性质表征发现,与Ac Cel9A相比,PT-box缺失突变体(Ac Cel9A-PT0)的酶活力在以CMC和RAC为底物时分别降低46.4%和52.1%。70℃条件下Ac Cel9airway infectionA-PT0的半衰期比Ac Cel9A降低0.38倍。上述结果表明,PT-box序列是提高酶活力和热稳定性的重要因素。综上,为了阐明多模块内切纤维素酶与不同底物相互作用的协同机制,本文以A.cellulolyticus 11B菌株中的两个多模块纤维素酶(Ac Cel9A和Ac Cel9B)为研究对象,探究各结构域和linker在酶分子热稳定性、与底物相互作用等方面发挥的功能。本研究为深入解析多模块纤维素酶GH9与不同底物的相互作用机制奠定了基础,也为开展PT-box序列介导的模块间协同作用研究提供了依ABT-199 MW据。