研究背景:糖尿病已成为一个全球性的公共卫生问题,长期患有糖尿病且血糖控制不佳的患者易引起人体大血管和微血管病变的发生,表现为基本结构和功能受到损害。血管病变进一步导致糖尿病创面等并发症的发生,严重威胁人民的生命安全和健康,也造成了沉重的经济负担。糖尿病创面的治疗是整形外科面临的挑战,困扰着世界各地的临床外科医生。研究表明,全身高血糖浓度导致蛋白质过度糖基化和晚期糖基化终产物的形成,导致促炎细胞因子的表达、氧化损伤和细胞外基质改变。高血糖浓度会抑制成纤维细胞、角质形成细胞和内皮细胞的增殖Pathologic grade。因此,开发一种能够快速止血、抑制细菌感染、减少氧化损伤及组织炎症、促进血管生成的方法成为糖尿病创面治疗的有效手段。值得注意的是,糖尿病创面的免疫功能紊乱也成为治疗的重要靶点。研究发现,糖尿病创面早期呈现免疫启动延迟,表现为免疫细胞浸润迟缓,而晚期则表现为促炎性细胞的广泛存在。通过促进免疫反应的早期启动并持续抑制其炎症表型,可能能够实现糖尿病创面的免疫重塑,最终促进糖尿病创面的愈合。由于水凝胶能够填充不规则的创面,保持湿润的环境,并具有可调节的机械性能和良好的生物相容性,在糖尿病创面的治疗中引发持续关注,因此,通过构建多组分水凝胶促进糖尿病创面的愈合成为研究的重要方向。研究目的:(1)探索针对快速止血、抑制细菌感染、减少氧化损伤及组织炎症、促进血管生成等功能构建的CS-DA/TA/PF/3D-Exos水凝胶是否具有良好的抗菌、抗炎、抗氧化、粘附和止血能力;(2)利用细胞和动物实验验证CS-DA/TA/PF/3D-Exos水凝胶是否能够促进糖尿病创面的愈合;(3)探索针https://www.selleck.cn/products/PF-2341066.html对早期快速启动免疫功能,持续发挥抗炎和促进巨噬细胞向M2型极化功能构建的OHA/GT/ECM/Cur/CCL2水凝胶是否能够重塑糖尿病创面免疫稳态;(4)通过体内外实验验证OHA/GT/ECM/Cur/CCL2水凝胶对糖尿病创面愈合的促进作用。研究方法和结果:(1)我们分别提取3D和2D外泌体,利用TEM、NTA和WB等手段进行了外泌体的鉴定。我们发现从3D培养中提取的外泌体的产量高于2D培养。进一步我们通过评价其对HUVECs、成纤维细胞和RAW264.7等的调控,在体外验证3D外泌体相对于2D外泌体的优势更适合糖尿病创面的治疗。在水凝胶的开发上,我们首先由二氢咖啡酸(多巴胺,DA)接枝抗菌阳离子聚合物壳聚糖(CS)来改善CS的水溶性,接着通过多巴胺多酚基团π-π叠加具有抗菌、抗炎、抗氧化作用的多酚结构单宁酸(TA)形成CS-DA/TA,然后通过CS接枝多巴胺的氨基与交联剂Pluronic F127-CHO(PF)的醛基反应形成动态的席夫碱键形成CS-DS/TA/PF,增加CS-DS/TA/PF水凝胶的力学性能和自愈合性能,最后通过多酚结构能够与外泌体外膜形成共价键结合,实现外泌体的负载与缓释,构建成CS-DA/TA/PF/3D-Exos水凝胶;(2)我们对构建的CS-DA/TA/PF/3D-Exos水凝胶的基本性能、安全性和生物学功能等进行了评价。我们发现水凝胶呈现连续的多孔结构,能够为细胞的生长和渗透以及营养,能迅速膨胀吸收创面渗出液,促进创面愈合。我们通过计数细菌克隆形成来评估抗菌活性,发现CS-DA/TA/PF/3D-Exos水凝胶具有良好的抑菌能力。为评价CS-DADS-3201抑制剂/TA/PF/3D-Exos水凝胶的生物相容性,我们进行了活/死细胞染色并测定溶血率,结果表明CS-DA/TA/PF/3D-Exos水凝胶具有良好的生物安全性和临床应用潜力;(3)为评价CS-DA/TA/PF/3D-Exos水凝胶促进糖尿病创面愈合的疗效,我们建立了小鼠全层皮肤缺损模型。研究发现,CS-DA/TA/PF/3D-Exos水凝胶治疗后创面愈合速度明显加快。H&E染色表明,CS-DA/TA/PF/3D-Exos水凝胶组皮肤成熟度最佳,表皮致密,真皮层组织良好,毛囊为成熟皮肤附属物。进一步采用Masson染色评价不同治疗组的胶原沉积,发现CS-DA/TA/PF/3D-Exos水凝胶组胶原纤维排列致密有序,表现出更成熟的表型。免疫荧光染色结果显示,创面愈合第7天CS-DA/TA/PF/3D-Exos水凝胶组的CD31表达高于其他各组,且14天CD31和α-SMA共表达水平高于7天,说明14天大部分创面处于重塑期。上述结果表明,CS-DA/TA/PF/3D-Exos水凝胶能够很好促进糖尿病创面的愈合。由于水凝胶的止血能力是非常重要的,在大鼠肝损伤模型和大鼠截尾模型中,通过测量出血量和止血时间来评价CS-DA/TA/PF/3D-Exos水凝胶的体内止血能力,结果表明CS-DA/TA/PF/3D-Exos水凝胶组具有良好的止血能力;(4)我们通过清洗、冻融、匀浆、胰酶、核酸酶、异丙醇等去油、去核酸,低温冻、研磨等步骤得到均一的ECM颗粒。通过标准方法制备出氧化透明质酸(OHA)后与GT进一步交联,并与ECM微粒进行均匀混合。通过红外光谱检测显示OHA制备成功并且与明胶发生了交联,与ECM颗粒也产生了均匀负载。我们通过OHA/GT负载CCL2,ECM颗粒负载Curcumin,然后将两种组分充分混合,制备出OHA/GT/ECM/Cur/CCL2水凝胶。对OHA/GT/ECM/Cur/CCL2水凝胶中CCL2和Curcumin的释放的检测结果显示,CCL2早期快速释放,而Curcumin的释放是一个缓慢持久的过程;(5)水凝胶的SEM分析显示,OHA/GT/ECM/Cur/CCL2水凝胶呈现连续的多孔结构。流变结果显示,在交联完成和加入了不同组分之后,水凝胶的机械性能和稳定性增强。水凝胶降解实验表明,OHA/GT/ECM/Cur/CCL2水凝胶在早期就会实现快速的降解,上述结果提示OHA/GT/ECM/Cur/CCL2水凝胶可以很好的适应创面的愈合需求。通过直接接触溶血实验和活/死细胞染色发现,OHA/GT/ECM/Cur/CCL2水凝胶具有良好的生物相容性。体外免疫荧光染色证实OHA/GT/ECM/Cur/CCL2水凝胶处理能够促进M2巨噬细胞极化,这些结果表明OHA/GT/ECM/Cur/CCL2水凝胶能够促进M2巨噬细胞极化,激活再生过程。(6)为评价OHA/GT/ECM/Cur/CCL2水凝胶在促进糖尿病创面愈合方面的疗效,我们建立了小鼠全层皮肤缺损模型。研究发现,小鼠经OHA/GT/ECM/Cur/CCL2水凝胶治疗后创面愈合速度明显加快。H&E染色表明,OHA/GT/ECM/Cur/CCL2水凝胶组皮肤成熟度最好。Masson染色评价不同治疗组的胶原沉积,发现OHA/GT/ECM/Cur/CCL2水凝胶组胶原纤维更成熟,排列更规则。PCR结果显示,OHA/GT/ECM/Cur/CCL2水凝胶具有良好的促巨噬细胞向M2型极化的能力。此外,OHA/GT/ECM/Cur/CCL2水凝胶组CD31和α-SMA表达水平最高。上述结果表明,OHA/GT/ECM/Cur/CCL2水凝胶能够很好促进糖尿病创面的愈合,其主要是通过多组分作用重塑了以巨噬细胞为基础的免疫稳态,为糖尿病的治疗提供了新的思路。研究结论:通过前期实验我们发现,CS-DA/TA/PF/3D-Exos水凝胶具有3D-Exos缓释、快速止血、去除ROS、抗菌、抗炎和粘附性能。动态席夫碱键和PF胶束使水凝胶具有优异的机械强度,DA/TA增加了水凝胶的湿组织粘附性,降低了治疗期间感染的风险。由于儿茶酚结构,DA/TA还通过激活血小板和与3D-Exos可逆相互作用来增强水凝胶的快速止血和外泌体释放特性。CS-DA/TA/PF和CS-DA/TA/PF/3D-Exos水凝胶在大鼠肝损伤模型和大鼠截尾模型中均表现出较好的止血时间和出血量。此外,CS-DA/TA/PF/3D-Exos水凝胶在创面愈合率、成纤维细胞迁移、表皮形成、肉芽组织厚度和胶原蛋白分布等方面对全层皮肤缺损模型的体内创面修复具有良好的治疗效果。CS-DA/TA/PF和CS-DA/TA/PF/3D-Exos水凝胶在体外实验中均表现出良好的生物安全性,具有抗菌、抗氧化、免疫调节和促进血管形成的能力,是用于慢性感染创面特异性治疗的理想策略。OHA/GT/ECM/Cur/CCL2水凝胶具有良好的组织相容性和粘附性能,通过OHA/GT快速降解和良好水溶性能够实现早期CCL2的快速释放,促进巨噬细胞等的早期募集,从而启动免疫反应。通过非水溶性的ECM/Cur的复合作用,在糖尿病创面持续发挥抗炎作用,有效促进巨噬细胞向M2型极化。通过重塑免疫稳态,有效促进了糖尿病创面的愈合率、成纤维细胞迁移、表皮形成、肉芽组织厚度和胶原蛋白分布等,是治疗糖尿病创面的新策略和新思路。