研究背景健康与疾病的发育起源理论(The Developmental Origins of Health and Disease,DOHaD学说)认为,宫内的不良环境会对胎儿的生长和发育造成影响,导致成年期疾病的发生。子痫前期(Preeclampsia,PE)是一种特发性妊娠障碍疾病,它的特点是在妊娠20周后出现高血压和蛋白尿的症状。肾脏是哺乳动物渗透调节、排泄和内分泌的重要器官,对于维持内环境稳态起到至关重要的作用,其发育受到子宫内环境的影响。PE可以导致胎儿肾脏发育不良,然而其具体病理机制尚不清楚。与正常妊娠相比,PE患者胎儿肾脏可表现为肾脏生长速度变慢、体积较小、肾单位及肾小球数目减少、结构和功能发生异常,并且肾脏血流异常发生的现象增加,胎儿出生后肾脏疾病的发生风险较高。胎盘源性外泌体(Placentalexosomes)由合体滋养层细胞通过溶酶体途径合成并释放,是一种重要的交流工具,在“母体-胎盘-胎儿信息交流”中发挥关键作用。胎盘缺氧、缺血被公认为是PE发生发展的关键因素,而“母体-胎盘-胎儿信息交流”对于维持正常妊娠及正常胎儿发育至关重要,在PE所致胎儿肾脏发育不良过程中,胎盘源性外泌体的作用及其机制仍不明确。本研究拟提取正常妊娠和PE患者脐血胎盘源性外泌体,利用体外、外植体及体内模型实验,全面探究胎盘源性外泌体对胎儿肾脏发育的影响。方法1.样本收集:本研究纳入山东大学附属省立医院2020年9月至2022年10月进行剖腹产的正常妊娠(n=10)和PE患者(n=10),收集其脐血,记录年龄、孕周、血压、蛋白尿、胎儿体重、胎盘重量等资料。2.提取胎盘源性外泌体:通过超速离心结合非线性蔗糖密度梯度离心法提取正常妊娠(N-exo)和PE患者(PE-exo)胎盘源性外泌体,利用透射电子显微镜(TEM)观察胎盘源性外泌体的形态及大小,纳米粒径分析(NTA)检测胎盘源性外泌体粒径分布,蛋白免疫印迹(WB)分析外泌体分子标志物的表达,对外泌体进行鉴定,BCA试剂盒测定外泌体浓度。3.N-exo和PE-exo对人肾小球内皮细胞(Human glomerular endothelial cells,HGECs)功能的影响:用N-exo和PE-exo分别处理HGECs,建立外泌体-HGECs互作模型,用荧光染料PKH67对胎盘源性外泌体进行标记,再与HGECs共培养24 h,通过高内涵共聚焦成像系统观察胎盘源性外泌体是否能够进入HGECs;EdU检测细胞的增殖能力;Evans-blue-BSA检测细胞的通透性;Transwell检测细胞的迁移功能;BD基质胶检测细胞的管腔形成能力;qRT-PCR和WB检测HGECs中细胞连接蛋白VE-cadherin和Occludin的表达。4.N-exo和PE-exo对胎鼠肾脏外植体生长发育的影响:用N-exo和PE-exo分别处理胎鼠肾脏外植体,建立外泌体-外植体互作模型,用荧光PKH67染料对胎盘源性外泌体进行标记,再与外植体共培养24 h,荧光显微镜观察胎盘源性外泌体是否能进入外植体;免疫荧光染色观察外植体的发育情况;qRT-PCR和WB检测外植体中细胞连接蛋白VE-cadheriAZD9291核磁n 和 Occludin 的表达。5.N-exo和PE-exo对胎鼠肾脏生长发育的影响:通过向妊娠小鼠羊膜腔注射N-exo和PE-exo,建立外泌体-胎鼠互作模型,用Dir染料标记胎盘源性外泌体,与胎鼠共培养24 h,小动物活体成像观察胎鼠对胎盘源性外泌体的摄取;记录胎鼠重量;PAS染色观察肾小球数目;qRT-PCR和WB检测肾脏中细胞连接蛋白VE-cadherin和Occludin的表达。结果1.与正常组相比,PE组血压及尿蛋白水平较高,胎儿体重较轻,胎盘重量较低,差异具有统计学意义。2.胎盘源性外泌体呈典型杯状或一侧凹陷的半球状磷脂双分子层结构,粒径集中在30-100nm之间,PLAP、CD63表达阳性,GM130表达阴性,提示胎盘源性外泌体提取成功,纯度较高,N-eNavitoclax细胞培养xo与PE-exo浓度之间无差异。3.PKH67染料标记的外泌体与HGECs共培养24h后,可见PKH67荧光分布于HGECs细胞核周围的细胞质中。与正常组相比,PE组细胞增殖能力降低,单层膜滤过膜屏障功能减弱,从而使蛋白漏hematology oncology出增多,通透性增强,迁移能力及成管腔形成能力降低,qRT-PCR和WB结果显示细胞连接蛋白VE-cadherin和Occludin的表达减少。4.PKH67染料标记的外泌体与外植体共培养24h后,可见PKH67荧光分布于外植体中。与正常组相比,PE组外植体生长面积较小,肾小球和输尿管芽数目较少,qRT-PCR和WB结果显示细胞连接蛋白VE-cadherin和Occludin的表达降低。5.Dir染料标记的外泌体注入妊娠小鼠羊膜腔内24h后,可见Dir荧光分布于胎鼠体内。与正常组相比,PE组胎鼠体重较低,肾小球数目较少,qRT-PCR和WB结果显示细胞连接蛋白VE-cadherin和Occludin的表达降低。结论胎盘源性外泌体作为“母体-胎盘-胎儿信息交流”的载体,对PE胎儿肾脏生长发育造成重要影响,可导致肾脏发育不良。我们的研究将为PE所致胎儿肾脏生长发育不良的发病机制提供新的理论依据,为其预防和治疗提供新的研究靶点,为母胎通讯提供新的研究策略,并为DOHaD学说提供新的实践支持。