小球藻和黄粉虫作为新型蛋白源应用到水产饲料是近几年的热点,在虾类中的研究大多集中在生化水平,鲜少有从分子水平探讨其替代鱼粉影响虾类生长、免疫机制的报道。本研究在前期两种蛋白源分别替代鱼粉对凡纳滨对虾生长性能研究的基础上,采用Rplant ecological epigeneticsNA-seq测序技术进行转录组学分析,得到两种蛋白源不同替代鱼粉比例下差异基因表达情况,对差异表达基因进行筛选,通过GO功能富集和KEGG富集分析,对相关信息进行整合,探讨小球藻粉和黄粉虫粉影响凡纳滨对虾生长及免疫的机制,为小球藻粉和黄粉虫粉在虾类饲料中的合理利用提供理论依据。试验一:基于转录组学分析小球藻粉替代鱼粉对凡纳滨对虾生长和免Adezmapimod供应商疫的影响机制本试验旨在通过转录组学分析小球藻粉(Chlorella Sorokiniana)替代鱼粉对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)生长性能和免疫功能的影响机制。前期试验配制了鱼粉含量为560g/kg的基础饲料,分别用小球藻粉替代基础饲料中0%(C0)、20%(C20)、40%(C40)、60%(C60)、80%(C80)和100%(C100)的鱼粉,配制6种等氮等脂的试验饲料,饲喂初始体重为1.37±0.02 g的凡纳滨对虾8周。生长结果显示,与对照组相比,C20组的末均重、特定生长率和饲料效率均显著提高(P<0.05);C40组生长性能和C0组无显著差异(P>0.05);当小球藻粉替代鱼粉水平≥60%后,对虾末均重、特定生长率和饲料效率均显著下降(P<0.05)。在此基础上开展对虾肝胰腺转录组学分析,结果显示:与对照组相比,C20组有322个差异表达基因(DEGs)(176个上调,146个下调);C40组有482个DEGs(246个上调,236个下调);C60组有804个DEGs(487个上调,317个下调);C80组有1080个DEGs(684个上调,396个下调);C100组有1262个DEGs(827个上调,435个下调)。将DEGs进行GO和KEGG功能富集分析发现,C20组的DEGs显著富集在几丁质结合和肌醇代谢过程等,还富集在C型凝集素受体信号通路、补体和凝血级联反应、b细胞受体信号通路等多个免疫相关信号通路中,且通路中多数基因表达上调;C40、C60、C80和C100组DEGs均显著富集在溶酶体、鞘脂代谢、蛋白质消化和吸收等信号通路中,且DEGs随着小球藻粉替代比例的升高而显著增多,此外,C60、C80和C100组还显著富集在脂质分解代谢过程等。综上所获悉更多述,在鱼粉含量为560 g/kg的凡纳滨对虾饲料中,小球藻粉替代鱼粉的20%,能促进肌醇等的代谢进而提高生长,激活C型凝集素受体等多个免疫信号通路,增强机体免疫功能;当小球藻粉替代鱼粉水平≥60%时,通过调控蛋白质消化和吸收、鞘脂代谢等信号通路影响机体对营养物质的吸收利用,并加剧机体脂质分解代谢,进而抑制对虾生长,同时通过溶酶体等信号通路影响对虾细胞稳态,降低免疫力。试验二:补充氨基酸和功能性添加剂对小球藻粉高替代组凡纳滨对虾生长、免疫及相关基因表达的影响为规避小球藻粉高比例替代后对凡纳滨对虾机体的负面影响,寻求高比例替代后的营养平衡方案。课题组在试验一基础上,挑选小球藻粉最适宜替代比例40%组作为正对照组(PC组),生长显著降低的80%组作为负对照组,在负对照组基础上补充必需氨基酸(组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸)和胆固醇至正对照组水平(AC组),在AC组基础上分别添加以及联合添加12.0 g/kg的微囊羟脯氨酸和12.0g/kg的微囊肌酸(AC-H、AC-C和AC-H+C组),共配制6种等氮等脂的试验饲料,饲养对虾(初体重1.20±0.02 g)8周。前期结果表明,补充限制性必需氨基酸、胆固醇并添加微囊羟脯氨酸和肌酸,可以改善对虾的生长性能。在此基础上,开展了各组免疫酶活的测定。结果显示,除PC组外,各组间的血清免疫酶活性均无显著差异(P>0.05)。AC-C组的肝胰腺ACP活性显著高于AC组(P<0.05)。AC-C组的PO活性显著高于PC组(P<0.05)。各组间肝胰腺SOD活性均无显著差异(P>0.05)。各组间副溶血弧菌感染累积死亡率均无显著差异(P>0.05)。在试验一基础上挑选出5个生长相关基因(DPP1、Actin-5C、PKB、Trypsin-1、CPB)以及3个免疫相关基因(HSC70、LZM、CTL4F)进行QPCR定量分析,结果表明,AC组Trypsin-1基因表达量显著高于NC组(P<0.05),其余基因与NC组均无显著差异(P>0.05)。AC-H组的Actin-5C、PKB和CTL4F相对表达量均显著高于AC组和NC组(P<0.05),Trypsin-1、CPB和HSC70表达量均显著低于AC组(P<0.05),其中Actin-5C表达量显著高于PC组(P<0.05),PKB、Trypsin-1、CPB、HSC70和CTL4F表达量与PC组达一致水平(P>0.05)。AC-C组和AC-H+C组的DPP1和CPB表达量显著低于AC组(P<0.05),与PC组无显著差异(P>0.05)。AC-H+C组LZM基因表达量显著高于AC组和PC组(P<0.05)。综上所述,在鱼粉含量为110 g/kg、小球藻粉含量为506.5 g/kg的凡纳滨对虾饲料中,补充限制性必需氨基酸和胆固醇并添加12 g/kg微囊羟脯氨酸和肌酸能显著促进对虾生长相关基因的表达,且添加羟脯氨酸还能显著上调免疫酶活及相关基因的表达,但未能抵消高比例小球藻粉替代鱼粉带来的负面影响。试验三:基于转录组学分析黄粉虫粉替代鱼粉对凡纳滨对虾生长和免疫的影响机制本试验旨在通过转录组学分析黄粉虫粉(Tenebrio molitor)替代鱼粉对凡纳滨对虾生长性能和免疫功能的影响机制。前期的实验设置鱼粉含量为560 g/kg的对照组(TM0)饲料,以黄粉虫粉等蛋白替代对照组饲料中20%(TM20)、40%(TM40)、60%(TM60)、80%(TM80)和100%(TM100)的鱼粉,配制6种等氮等脂的试验饲料,饲喂初始体重为1.36±0.10 g的凡纳滨对虾8周。结果显示,随着TM替代比例的升高,各组增重率逐级显著降低(P<0.05),与对照组相比,存活率在TM40组与对照组间无显著差异(P>0.05),从TM60组开始显著下降(P<0.05),TM80组存活率最低。在此基础上,开展了各组别免疫相关指标测定。结果显示,各组血清SOD活性均无显著差异(P>0.05)。随着TM替代比例的升高,各组血清AKP和PO活性呈下降趋势,ACP活性和NO含量呈上升趋势,均从TM60组开始发生显著变化(P<0.05),TM20组和TM40组较对照组均无显著差异(P>0.05)。与对照组相比,TM40组肝胰腺AKP活性显著升高(P<0.05),SOD活性和NO含量显著下降(P<0.05)。TM20组PO活性与对照组无显著差异(P>0.05)。感染副溶血弧菌后TM80组累计死亡率最高。同时,挑选对照组、TM40组、TM80组进行转录组学分析,结果显示,与对照组相比,TM40组、TM80组与对照组的差异表达基因均显著富集到精氨酸和脯氨酸代谢、胆碱在肿瘤中的代谢、赖氨酸生物合成、叶酸的生物合成等信号通路。TM40组显著下调了叶酸生物合成相关基因和糖异生相关基因的表达量,上调PPAR信号通路中免疫相关基因酰基辅酶a结合蛋白基因的表达量。TM80组显著下调了9-顺式维甲酸代谢与生物合成相关基因的表达量,显著上调了细胞色素P450解毒相关基因谷胱甘肽硫转移酶1样基因。综上所述,在鱼粉含量为560 g/kg的基础饲料中,黄粉虫粉替代40%鱼粉会影响凡纳滨对虾氨基酸和叶酸的合成与代谢,替代80%鱼粉会激活机体解毒机制,降低机体免疫。