山茶花(Camellia japonica L.)为我国传统十大名花之一,常用于室内景观、园林造景,同时,山茶花多酚和黄酮类物质具有药理功能,是具有极高的观赏价值和经济价值的植物。山茶花品种数量庞大,在各地被广泛引种栽培,遍布世界,但是山茶花品种存在分类分歧,加上长期的引种种植,有大量品种出现同名异物或同物异名,针对这一现象,本研究对53个山茶花品种进行遗传多样性分析,并结合表型性状聚类分析,为山茶花品种分类提供依据,根据遗传多样性分析结果选择花型及花色两个性状进行后续研究。花型和花色是山茶花两大重要观赏性状,花型主要由花器官发育的ABCDE型基因共同调控,关于ABC型基因在山茶花型的调控机制中已经相对清晰,但是E型基因在花器官发育中的功能研究较少。本研究开展了E型基因克隆及表达分析,同时进行了E型基因的遗传转化,为通过基因工程改造花型提供技术支撑。山茶花除了花型多样其颜色也繁多,其色素成分主要为花青素等酚类物质,本研究对山茶花花青素合成关键基因的表达情况进行分析,同时研究了不同品种及愈伤组织中花青素等次生代谢产物的含量,以期为山茶花种质资源创新利用提供理论依据。主要的研究结果如下:1.53个山茶花品种遗传多样性分析利用表型性状结合CDDP分子标记技术对53个山茶花品种(品系)进行遗传多样性和群体结构分析。结果表明,花瓣数和花瓣内侧次色形状两个性状较其他性状变异系数高,分别为48.71%和65.05%;CDDP分子标记结果中28个引物多态性高达98.68%,PIC高达0.905,有效等位基因、Nei’s遗传相似性系数和Shanno信息指数分别为1.380、0.245、0.386。通过群体结构分析,53个山茶花品种(系)被分为4个类群,在此基础上,将表型性状观测值与CDDP标记结果作关联分析,529个位点中出现65个位点与11个表型具有显著关联性(p<0.01),花径和花型两个性状均与11个位点相关联。2.山茶花E型基因克隆及表达分析利用RACE克隆技术,从完全重瓣品种‘胭脂牡丹’中分离得到3条E型基因:Cj SEP1a(1235 bp)、Cj SEP3(967 bp)、Cj SEP4a(1725 bp),NCBI登录号分别为:OP172861、OP172863、OP172864。3条基因编码的蛋白均为亲水性核蛋白,且具有K-box,为MADS-box特有蛋白结构域。经过同源性分析,Cj SEP1a、Cj SEP3和Cj SEP4a基因与同属物种茶树(Camellia sinensis)的E型基因同源性更高,聚类值达到100。q PCR分析表明,Cj SEP1a基因在半重瓣及完全重瓣品种中表达量超过了单瓣品种,而其他花型则相对较低,托桂型品种中几乎不表达;Cj SEP3基selleck HPLC因与Cj SEP1a基因相差不大,但在6个不同类型山茶花品种中整体表达量高于Cj SEP1a;Cj SEP4a基因在完全重瓣和牡丹型重瓣中较单瓣型表达量较高,特别是重瓣品种中几乎达到单瓣型的3倍,在其余品种中则较低,托桂花型中极低。3.Fracture-related infection山茶花E型基因植物表达载体构建及愈伤组织遗传转化以3个E型基因为目的基因,成功构建pAlpelisib化学结构 BI121-SEP-GFP植物表达载体。诱导单瓣品种‘美人茶’愈伤组织培养,并获得状态良好的愈伤组织,将E型基因成功稳定遗传转化入‘美人茶’愈伤组织。经过PCR验证获得10个阳性转基因材料。以转基因阳性材料p BI121-Cj SEP1a-GFP和p BI121-Cj SEP4a-GFP为模板进行实时荧光定量反应,p BI121-Cj SEP1a-GFP过表达载体对Cj SEP3和Cj SEP4a基因、p BI121-Cj SEP4a-GFP过表达载体对Cj SEP1a和Cj SEP3基因具有抑制表达效果;p BI121-Cj SEP4a-GFP过表达载体对Cj SEP4a具有促进表达的效果。此现象说明E型基因两两之间存在协同表达情况。4.不同颜色山茶花花瓣和‘美人茶’愈伤组织中花色素合成通路关键基因表达模式分析不同颜色山茶花色素生物合成通路上,黄色品种‘黄的旋律’中的CHS基因表达量较高,而F3’H和DFR基因的表达量均不如白色对照品种‘杰作’。在愈伤组织中,除CHI和UFGT基因,其余5个基因(CHS、F3H、F3’H、DFR、ANS)均为培养30 d的愈伤组织表达量高于35 d的愈伤组织。这说明山茶花花色素合成相关基因表达因品种的不同而存在差异,同时,不同培养阶段的山茶花愈伤组织,其花色素合成相关基因表达也存在差异,为进一步开展山茶花花色素的定向合成研究提供了线索。5.花瓣与愈伤组织次生代谢产物含量测定本研究表明,山茶花瓣中总酚、类黄酮、原花青素、花色苷等含量高于愈伤组织中的含量,红色品种‘赤丹’花瓣中总酚含量最高,达到143.53 mg/g,而愈伤组织干样中40 d最高为50.35 mg/g;紫红色品种‘午夜’中类黄酮、原花青素、花色苷含量最高,分别为18928.10μg/g、133324.07μg/g、541.33μg/g。利用色素合成通路上关键基因表达量与各次生代谢产物含量进行相关性分析,结果为总酚与F3H为极显著正相关(P<0.01),类黄酮和花色苷与F3H基因为显著正相关(P<0.05)。