研究背景:慢性炎症是糖尿病及其并发症、痛风、高血压等代谢性疾病的危险因素,而这种炎症的持续性激活与抗炎反应的失调密切相关。巨噬细胞凭借其所具有的广泛可塑性深入参与到慢性炎症的调节过程。巨噬细胞的不同极化状态是其可塑性的主要标志,巨噬细胞可极化为参与促炎状态维持的M1型和发挥抗炎作用的M2型。因此,调节巨噬细胞的极化状态是改善炎Biofeedback technology症环境的有效治疗方法。这种巨噬细胞极化的重塑依赖于细胞内的代谢重编程。M1型巨噬细胞主要依赖于有氧糖酵解,M2型巨噬细胞则主要利用氧化磷酸化代谢途径。这表明作为细胞能量代谢中枢的线粒体通过影响代谢重编程来参与巨噬细胞的活化和可塑性。线粒体由于经常暴露于高水平的活性氧(ROS)下,因而容易受到氧化损伤。基于此,线粒体进化出多种质量控制系统来确保存在必需数量的功能性线粒体以满足细胞的需求。线粒体质量控制系统包括线粒体未折叠蛋白反应(UPRmt)、线粒体动力学,线粒体自噬等。线粒体通过分裂、融合、而表现出高度可变的形状、大小和位置以满足细胞的动态需求,这些统称为线粒体动力学。在异常蛋白积累时,线粒体可以通过UPRmt介导核转录伴侣蛋白和蛋白酶上调的信号级联反应,通过对错误累积蛋白的降解来帮助维持线粒体的稳态。研究已经表明,线粒体质量控制的失调与炎症性疾病密切相关。高温需求因子2(High temperature requirement factor A2,Htr A2/Omi)是一种核编码的线粒体丝氨酸蛋白酶,位于线粒体的膜间隙。以往的研究多关注其在神经退行性疾病、肌少症以及肿瘤中的潜在调节作用。最近的研究表明,Htr A2/Omi蛋白也是线粒体分子质量控制的重要调节剂。Htr A2/Omi蛋白可以通过其具有的酶活性参与UPRmt中错误累积蛋白的降解,保持线粒体的正常功能,还参与线粒体动力相关蛋白的相互作用,维持线粒体形态等,这提示Htr A2/Omi蛋白可能在线粒体质量控制中发挥重要作用。因此,本研究以Htr A2/Omi蛋白为切入点,探讨线粒体质量控制在巨噬细胞极化相关的炎症调节中的作用,本研究利用Htr A2/Omi基因突变小鼠的骨髓来源巨噬细胞(BMDMs),首先研究Htr A2/Omi蛋白在小鼠BMDMs的线粒体质量控制中扮演的角色,其次观察线粒体质量控制对巨噬细胞极化代谢方式的转变,最后再观察对线粒体功能的影响,进一步阐明线粒体质量控制在糖尿病等慢性炎症性疾病中发挥的潜在作用。实验方法:1.以野生型WT、Htr A2/Omi基因突变小鼠杂合子Htr A2~(mnd2(+/-))和纯合子Htr A2~(mnd2(-/-))为实验对象,观察小鼠生理学指标变化,同时Western blot法检测各基因型小鼠BMDMs的Htr A2/Omi表达情况。2.分别在脂多糖(LPS),白介素-4(IL-4)作用下,Western blot法检测各基因型小鼠BMDMs中线粒体融合分裂过程有关的线粒体动力相关蛋白-1(DRP1)、线粒体融合蛋白-1(MFN1)、视神经萎缩蛋白-1(OPA1)、金属蛋白酶OMA1的表达水平变化以及UPRmt相关线粒体蛋白分子伴侣热休克蛋白60(HSP60)和热休克蛋白90(HSP60)的表达水平变化,以评估Htr A2/Omi蛋白对小鼠BMDMs线粒体质量控制的影响。3.q PCR法检测各基因型小鼠BMDMs在IL-4作用下M2极化标志基因精氨酸合酶(Arg1)、甘露糖受体C1(Mrc1)、小鼠类几丁质酶样分子(YM1)的转录水平变化以及M1极化标志基因白介素-1α(IL-1α)、白介素-1β(IL-1β)和干扰素-γ(IFN-γ)的转录水平变化。并检测IL-4对各基因型小鼠BMDMs ATP的生成,葡萄糖摄取以及乳酸生成的影响,同时检测细胞外氧气消耗速率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)的变化,探究各基因小鼠BMDMs的极化倾向以及代谢模式的改变。4.利用免疫荧光和mt DNA拷贝数检测的方法检测IL-4作用下各基因型小鼠BMDMs的线粒体数量变化。5.利用流式细胞术和免疫荧光的方法检测IL-4作用下各基因型小鼠BMDMs的线粒体ROS水平、氧化应激损伤标志FG-4592作用物8-羟基脱氧鸟苷(8-OHDG)水平和线粒体膜电势的变化,以评估线粒体的功能。实验结果:1.Htr A2~(mnd2(+/-))与WT相比,两者的生理表现无明显差异,而Htr A2~(mnd2(-/-))小鼠出生14天后生长停滞,体重随时间而逐渐减轻,最终在30天左右死亡,期间伴随有震颤、运动失调等症状。与WT相比,Htr A2~(mnd2(+/-))小鼠BMDMs的Htr A2/Omi蛋白表达略升高,Htr A2~(mnd2(-/-))小鼠BMDMs的Htr A2/Omi蛋白水平显著降低。2.(1)与WT相比,Htr A2~(mnd2(+/-))小鼠BMDMs的DRP1和OMA1表达降低,MFN1表达升高,OPA1表达无明显差异;Htr A2~(mnd2(-/-))小鼠BMDMs的DRP1表达无明显差异,MFN1和OMA1表达升高,同时经水解后截短的OPA1蛋白表达水平相应升高。经LPS刺激后,与WT相比,Htr A2~(mnd2(+/-))小鼠BMDMs的DRP1和OMA1表达显著降低,MFN1表达升高,OPA1表达水平显著升高;Htr A2~(mnd2(-/-))小鼠BMDMs的DRP1和OPA1表达降低,MFN1表达升高,OMA1表达显著升高。经IL-4刺激后,与WT相比,Htr A2~(mnd2(+/-))小鼠BMDMs的DRP1表达显著降低,MFN1表达明显升高,OMA1表达降低,OPA1蛋白表达无明显差异;Htr A2~(mnd2(-/-))小鼠BMDMs的DRP1和MFN1表达降低,OMA1表达明显升高,OPA1表达明显降低。(2)与WT相比,Htr A2~(mnd2(+/-))小鼠和Htr A2~(mnd2(-/-))小鼠BMDMs中HSP60和HSP90蛋白表达略增加。在LPS刺激后,与WT相比,Htr A2~(mnd2(+/-))小鼠BMDMs的HSP60和HSP90表达无明显差异,Htr A2~(mnd2(-/-))小鼠BMDMs的HSP60和HSP90表达明显降低。在IL-4刺激后,与WT相比,Htr A2~(mnd2(+/-))小鼠BMDMs的HSP60和HSP90表达均降低,Htr A2~(mnd2(-/-))小鼠BMDMs中HSP60和HSP90表达明显降低。3.(1)与WT相比,Htr A2~(mnd2(+/-))小鼠BMDMs中M2极化标志基因Arg1和Mrc1转录水平降低,YM1转录水平升高;Htr A2~(mnd2(-/-))小鼠的BMDMs中Arg1和Mrc1转录水平明显降低,YM1转录水平升高。经IL-4刺激后,Htr A2~(mnd2(+/-))小鼠BMDMs中Arg1、Mrc1以及YM1转录水平均升高,Htr A2~(mnd2(-/-))小鼠BMDMs的Arg1、Mrc1以及YM1转录水平明显降低。Htr A2~(mnd2(+/-))小鼠BMDMs的M1极化标志基因IL-1α、IL-1β、IFN-γ的转录水平均明显降低,而Htr A2~(mnd2(-/-))小鼠BMDMs的IL-1α和IL-1β转录水平升高,IFN-γ的转录水平降低。(2)与WT相比,Htr A2~(mnd2(+/-))小鼠BMDMs的ATP生成减少、葡萄糖摄取量和乳酸生成量均明显增加;Htr A2~(mnd2(-/-))小鼠BMDMs的ATP生成减少,葡萄糖摄取量和乳酸生成量均增加。经IL-4刺激后,Htr A2~(mnd2(+/-))小鼠BMDMs的ATP生成和葡萄糖摄取量以及乳酸生成均增加,Htr A2~(mnd2(-/-))小鼠BMDMs的ATP生成和葡萄糖摄取量降低,乳酸生成增加。(3)与WT相比,Htr A2~(mnd2(+/-))和Htr A2~(mnd2(-/-))小鼠的OCR和ECAR均上升,经IL-4刺激后,Htr A2~(mnd2(+/-))和Htr A2~(mnd2(-/-))小鼠的OCR和ECAR依旧上升。4.与WT相比,Htr A2~(mnd2(+/-))小鼠和Htr A2~(mnd2(-/-))小鼠BMDMs中具有更多的线粒体数量。经IL-4刺激后,Htr A2~(mnd2(+/-))小鼠BMDMs中线粒体数量进一步增多,Htr A2~(mnd2(-/-))小鼠BMDMs中线粒体数量减少。5.(1)与WT相比,Htr A2~(mnd2(+/-))小鼠BMDMs线粒体ROS水平升高,Htr A2~(mnd2(-/-))小鼠BMDMs线粒体ROS水平显著升高。经IL-4刺激后,与WT相比,Htr A2~(mnd2(+/-))小鼠BMDMs线粒体ROS水平无明显差异,Htr A2~(mnd2(-/-))小鼠BMDMs中线粒体ROS水平升高。(2)与WT相比,Htr A2~(mnd2(+/-))小鼠BMDMs的8-OHDG水平升高,Htr A2~(mnd2(-/-))小鼠BMDMs中8-OHDG的升高显著。IL-4刺激后,与WT相比,Htr A2~(mnd2(+/-))中8-OHDG水平升高,Htr A2~(mnd2(-/-))小鼠BMDMs中8-OHDG水平明显升高。(3)与WT相比,Htr A2~(mnd2(+/-))小鼠和Htr A2~(mnd2(-/-))小鼠BMDMs的膜电势升高,经IL-4刺激后,Htr A2~(mnd2(+/-))小鼠BMDMs的膜电势仍升高,Htr A2~(mnd2(-/-))小鼠BMDMs的膜电势显著降低。结论:Htr PLX5622生产商A2/Omi蛋白酶缺失导致的线粒体质量控制失调抑制了IL-4诱导的以氧化磷酸化为主要代谢途径的巨噬细胞M2型极化转变,并通过增加氧化应激水平共同导致了促炎与抗炎的失衡,进而导致慢性炎症的持续激活。通过恢复受损的线粒体质量控制来调节炎症反应平衡可能是减轻慢性炎症激活的潜在方向。