肝脏是动物机体免疫系统中处于前线的免疫器官之一,由于肝脏和肠道起源于共同的胚胎,并且肝脏中大部分血液由门静脉供应,而胃肠道的血液进入体循环前先全部都经门静脉流入肝脏,所以肝脏和肠道在动物机体生长发育和免疫应答中存在密不可分的关系。由于门静脉血液中可能包含大量外来的无害微生物,而肝脏被人们普遍认为具有抗炎或免疫耐受功能。肠道的共生菌和益selleck化学生菌能够进入血液循环系统,跟随血液抵达其他组织器官,通过其代谢产物影响着动物机体的稳态调节。最新研究发现在肝癌组织中能够检测到多种微生物,其中益生菌乳酸杆菌含量最高。免疫系统受损的肝脏组织中发现有大量益生菌定植,那么益生菌能否在健康的肝脏组织中定植还未可知。本试验旨在探索干酪乳杆菌是否可以通过腹腔注射的方法在健康的肝脏组织中定植,并发挥何种生物学和免疫学作用,以及探究干酪乳杆菌如何逃避巨噬细胞的免疫吞噬最终在肝脏组织中定植的潜在分子机制。首先,通过对小鼠腹腔注射不同浓度的干酪乳杆菌方法,采集肝脏组织悬液做体外细菌培养并进行细菌肝脏定植的动力学分析。研究发现腹腔注射的干酪乳杆菌可以在肝脏中定植,具有明显的剂量依赖性,并且定植细菌的数量没有随着时间推移而显著减少。同时,通过HE染色和透射电子显微镜对小鼠肝脏、结肠组织病理学观察研究发现,低浓度的干酪乳杆菌定植肝脏后对肝脏和结肠组织没有显著的病理学变化,而高浓度的干酪乳杆菌定植肝脏后,肝脏组织会出现轻微肝损伤、细胞间隙增大、肿胀、组织纤维化,会有脂泡出现,并伴有线粒体结构损伤;结肠组织会出现隐窝轻微退化,线粒体损伤等病理性变化。利用实时荧光PCR方法分析肝脏定植干酪乳杆菌后肝脏组织中炎性相关因子表达量的变化。结果显示,干酪乳杆菌定植肝脏后,肝组织中的促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-17f和JAK的m RNA表达量下降,同时抗炎因子IL-10、IL-22和生长因子Wnt的m RNA表达量上升,表明干酪乳杆菌定植肝脏后能够抑制肝脏内促炎因子的表达,并促进肝脏组织的生长发育。通过使用流式细胞术分析肝脏定植干酪乳杆菌后对肝枯否细胞增殖分化的影响,结果表明干酪乳杆菌定植肝脏后可以促进肝脏枯否细胞的增殖分化。随后本试验探究了干酪乳杆菌如何突破免疫逃避定植肝脏组织器官的细胞分子机制。将干酪乳杆菌和小鼠腹腔巨噬细胞体外共培养,通过免疫荧光技术和激光共聚焦技术确定干酪乳杆菌与小鼠腹腔巨噬Medical range of services细胞的交互位置关系。在免疫荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察到,干酪乳杆菌紧贴在小鼠腹腔巨噬细胞表面,未被巨噬细胞所吞噬降解。研究确定干酪乳杆菌对腹腔巨噬细胞具有免疫逃避特性。流式细胞术分析结果进一步说明,干酪乳杆菌能够躲避小鼠腹腔巨噬细胞的免疫吞噬作用。同时,使用流式细胞术和q RT-PCR对干酪乳杆菌诱导小鼠腹腔巨噬细胞分化亚型进行分析。流式细胞术结果发现,干酪乳杆菌能够打破M1/M2巨噬细胞平衡,诱导巨噬细胞向M2型巨噬细胞增殖分化。RTq-PCR结果表明,干酪乳杆菌能够诱导小鼠M2型巨噬细胞相关细胞因子和趋化因子IL-10、Arg-1、TGF-β、CD206和IL-4表达,抑制M1型巨噬细胞相关细胞分子i NOS、IL-1β、IFN-γ表达。上述研究结果表明,干酪乳杆菌对小鼠腹腔巨噬细胞具有免疫逃避机制,并且干酪乳杆菌能够通过促进小鼠M2型巨噬细胞相关细胞因子和趋化因子的表达,进而诱导小鼠腹腔巨噬细胞向M2型巨噬细胞增殖分化。为了进一步探究干酪乳杆菌在畜牧生产中的应用效果,我们探究干酪乳杆菌突破猪巨噬细胞发挥免疫逃避的细胞分子机制,同样利用体外共培养技术。通过流式细胞术、激光共聚焦技术探究干酪乳杆菌对猪巨噬细胞活性和吞噬能力的影响,结果显示,干酪乳杆菌能够躲避猪巨噬细胞的吞噬作用,并且能够促进猪巨噬细胞增殖分化。使用免疫荧光技术、RTq-PCR和Western Blot对干酪乳杆菌诱导猪巨噬细胞分化亚型进行分析,确定干酪乳杆菌打破巨噬细胞M1/M2免疫平衡,诱导M0巨噬细胞向M2巨噬细胞分化并发挥免疫逃避作用。在免疫荧光显微镜下可以观察到,干酪乳杆菌能够促进M2型猪巨噬细胞表面标志物CD206表达;RTq-PCR结果表明,干酪乳杆菌刺激M2型猪巨噬细胞相关细胞分子Arg1、TNF-α、CD206、IL-10、TGF-β表达;Western Blot结果表明,干酪乳杆菌可以激活IL-4和Arg-1蛋白表达,抑制i NOS蛋白表达。上述研究结果表明,干酪乳杆菌通过激活IL-4信号通路诱导猪巨噬细胞向M2型分化,从而诱导巨噬细胞发挥抗炎作用和干酪乳杆菌逃避巨噬细胞的吞噬作用。综合上述研究我们可以得出结论,干酪乳杆菌可以通过腹腔注射的途径定植到肝脏组织中,且具有一定的剂量依赖性,能够调节肝脏的免疫功能,有助于肝脏组织的生长发育。同时在小鼠和猪的巨噬细胞上发现干酪乳杆菌能够打破巨噬细胞M1/M2的免疫平衡,干酪乳杆菌黏附在巨噬细胞表面,诱导巨噬细胞向发挥抗炎作用的M2型巨噬细胞分化,从而发挥巨噬细胞的免疫逃避特性。本研究从益生菌干酪乳杆菌和宿主细胞之间的交互作selleck NMR用及信号分子机理上详细解析了腹腔注射干酪乳杆菌在肝脏中定植的免疫逃避机制,研究首次创新性地从益生菌肝脏定植、免疫逃避和抗炎等方面阐明了干酪乳杆菌以往很多益生作用的免疫、细胞和分子机制,为研究肠-肝轴等新兴科学问题指明新的研究方向,为进一步探究干酪乳杆菌对动物机体固有免疫的影响提供新的科学参考。