法医学实际检案中经常会遇到遭受重大情感变故、工作压力、非法限制人身自由、突然被羁押等应激刺激后发生死亡的案件,经过现场勘验、尸表检查、系统解剖、毒物筛查及组织病理学检查后,发现受害者仅存有非致命性损伤甚至无明显损伤,因此,死因无法明确,常常造成案件的累诉缠诉,严重影响着司法的公平公正。在排除所有死因的前提下,我学科带头人在世界范围内首次提出了应激性死亡的科学假说。这些案件所存在的共同特点,即明显的精神心理应激和/或躯体应激。尽管目前的研究已表明应激可以导致中枢神经系统损伤以及胃肠道等机体重要脏器的损伤,但确切的损伤机制仍不甚清楚,更为重要的是应激与死亡的相关关系,目前国内外研究尚属空白,因此本研究是探讨应激与死亡相关关系初始阶段的基础研究,旨在为法医学实际案例的死因鉴定提供科学理论依据。应激是指机体受到应激原刺激(躯体和/或精神心理刺激)时出现的一系列神经内分泌及生理、病理反应。机体通过激活下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴和蓝斑-交感-肾上腺髓质轴来促进激素释放,使血液中儿茶酚胺(肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺)、糖皮质激素、甲状腺激素、胰高血糖素以及血管紧张素等水平迅速升高,以此来增强和抵御外界刺激的能力维持机体稳态。心脏是机体循环系统的动力来源,也是机体感知和应对应激反应的重要器官。应激时机体通过增强交感神经和HPA轴活性使作用于心脏的儿茶酚胺和糖皮质激素等水平迅速增加,导致心率加快、心肌收缩力增强,从而满足机体的各种代谢需求。但是,过强和/或时间过长的应激则会增加心血管疾病的风险,如高血压、糖尿病、肥胖症等。除此之外,过度应激也会直接导致心脏损伤,造成心肌缺血和心肌重塑等。然而,目前对应激导致心脏损伤影响心功能的具体分子机制仍然尚不清楚。心脏功能的维持需要大量能量,而这些能量正是由线粒体所提供。线粒体是高度动态的结构,它负责生成载能分子三磷酸腺苷(ATP),并调节心脏中与动力相关的细胞过程。以往的研究表明成人心肌细胞40%以上的细胞质空间被大量的线粒体所占据,它们主要位于心肌细胞的肌节之间、细胞核周围和浆膜下,并持续不断的为心肌收缩提供能量。线粒体同时也是细胞应激的敏感细胞器,它能通过不断的形态学改变来满足应激时细胞的各种能量代谢需求。线粒体形态由线粒体融合和裂变调节,通过严格的质量控制决定着线粒体功能。线粒体融合是由线粒体融合蛋白1(mfn1)、线粒体融合蛋白2(mfn2)调节的外膜融合以及视神经萎缩蛋白1(opa1)调节的内膜融合组成,能够实现线粒体DNA(mt DNA)、蛋白质、脂质以及代谢物的交换,并通过内容物混合介导功能互补最大限度的增强细胞应对外界刺激的反应能力。此外,线粒体融合还能增强内膜嵴的完整性促进氧化磷酸化增加ATP的生成,从而满足细胞对能量的需求。线粒体裂变是由动力相关蛋白1(Drp1)所介导,其通过丝氨酸616位点发生磷酸化后与线粒体外膜的配体线粒体分裂蛋白1(Fis1)结合,寡聚收缩并切割线粒体膜使其碎片化。适度的裂变有利于清除损伤的线粒体维持细胞稳态而过度的裂变则会导致细胞损伤。在生理状态下,线粒体融合成管网状抵御外界刺激维持动态平衡,但当外界刺激破坏线粒体融合裂变动态平衡时,线粒体融合减少而线粒体裂变相应增多。越来越多的证据表明线粒体融合裂变紊乱引发的线粒体功能障碍是机体众多疾病发生发展的一个重要原因。线粒体作为高度动态的细胞器还与内质网等其他细胞器之间存在着相互作用并进行信息传递。在细胞生物活动中线粒体内质网之间形成的紧密接触-线粒体相关内质网膜-具有重要调节功能包括能量代谢和促进细胞死亡。因此,当线粒体功能障碍导致线粒体内质网之间信号传递紊乱时就会启动内质网应激反应,影响细胞内蛋白质、脂质的合成以及翻译后修饰,使细胞进一步陷入不可逆转的恶性循环中。有研究结果表明线粒体功能障碍引发的钙超载、活性氧增多等能够激活内质网应激IRE1α-ASK1-JNK损伤信号通路。肌醇依赖酶1α(IRE1-α)具有丝/苏氨酸蛋白激酶和核糖核酸内切酶的结构域/特性,在促进细胞存活和损伤过程中扮演着双重角色。IRE1-α主要是催化Xbp1 mRNA的剪切导致转录因子激活并转位到核内启动转录基因参与蛋白质的折叠和降解维持内质网稳态。在内质网应激过程中,ERN1基因编码的IRE1-α选择性的剪切XBP1mRNA中26个核苷酸片段形成具有转录活性的XBP1(XBP1s)进入细胞核。而受IRE1α–XBP1调节的基因则促进蛋白的折叠和转运以及增强蛋白的降解,从而缓解内质网中的蛋白负荷。但是持续的内质网应激会导致IRE1-α激活并募集TNF受体相关因子2(TRAF2)以及凋亡信号调节激酶1(ASK1)和下游因子氨基末端激酶(JNK),JNK的过度表达能够导致细胞死亡。基于以上研究背景和现状,我们提出了假说:应激能够诱导敏感器官心肌细胞发生线粒体融合裂变紊乱,影响线粒体内质网之间的信号传递并激活内质网应激IRE1α-ASK1-JNK损伤信号通路最终导致心肌细胞损伤。为了验证假说,本研究在成功建立应激大鼠模型和体外培养H9C2心肌细胞系的基础上,详细观察了应激对心脏的损伤变化并探讨了心肌细胞线粒体融合裂变紊乱和内质网应激参与心肌细胞损伤的分子机制,旨在为进一步明确应激导致机体重要脏器心脏损伤甚至引发机体死亡提供理论依据。第一部分应激诱导大鼠心脏损伤的病理形态学研究目的:本研究在成功建立不同时长束缚加冰水游泳应激大鼠模型的基础上,通过生化检测、心电图(ECG)、HE染色、变色酸-2R-Trimmed L-moments亮绿染色、免疫组织化学染色等方法详细观察了不同时长应激对大鼠心脏的影响。方法:1.建立不同时长束缚加冰水游泳应激大鼠模型,通过检测大鼠体重变化、血清去甲肾上腺素(NE)水平、行为学变化以及大鼠粪便等评价应激大鼠模型建立成功。2.Elisa方法检测血清中乳酸脱氢酶(LDH)的含量,ECG检测心律的变化,通过生化指标和心律评价应激后心肌损伤情况。3.HE、变色酸-2R-亮绿染色观察应激导致心脏损伤的病理形态学改变。4.免疫组化检测应激对心肌细胞β1肾上腺素能受体(β1-AR)和骨架蛋白(desmin)的影响。结果:1.相较于正常对照组,应激使大鼠体重增长明显减缓,血清中去甲肾上腺素水平随应激时间延长显著性增加,大鼠在开放臂停留时间以及进入开放臂的次数明显减少,且应激大鼠的粪便数量明显增加,表明应激大鼠模型建立成功。2.随着应激时间的延长,大鼠血清中LDH含量显著性增加,表明应激可以导致心肌细胞明显损伤;ECG结果显示:应激可以导致大鼠心脏发生ST段抬高,心率加快,表明应激可使大鼠心律发生紊乱。3.HE染色结果显示:随着应激时间的延长心肌细胞发生水肿、嗜酸性变,心肌间质炎细胞浸润;变色酸-2R亮绿染色结果显示:随着应激时间的延长,心肌细胞发生缺血缺氧改变。4.免疫组化结果显示:应激能够显著性增加心肌细胞β1-AR的表达,而使心肌纤维骨架蛋白表达明显降低。小结:在建立不同时程束缚加冰水游泳应激大鼠模型的基础上,通过体重变化、激素水平、行为学实验及大鼠粪便等证实了应激大鼠模型建立成功。通过心肌细胞损伤相关生化指标LDH、心电图变化、组织化学染色等方法证实随着应激时间的延长,大鼠心肌细胞发生明显的损伤改变。第二部分应激诱导线粒体损伤启动内质网应激参与心肌细胞损伤目的:在成功建立应激大鼠模型的基础上,通过对心肌细胞线粒体超微结构观察以及检测线粒体融合裂变标志蛋白、活性氧(ROS)表达及内质网应激相关蛋白的表达变化规律,探讨应激诱导线粒体融合裂变紊乱启动内质网应激参与心肌细胞损伤的分子机制。方法:1.透射电子显微镜观察不同时长应激对大鼠心肌细胞线粒体超微结构的影响以及使用线粒体裂变抑制剂Mdivi-1前后心肌细胞线粒体的超微组织结构变化。2.RT-qPCR及Western blot检测不同时长应激大鼠心肌细胞线粒体融合蛋白(mfn1、mfn2、opa1)、裂变蛋白(Drp1~(ser616)、Drp1、fis1)、细胞色素c(Cyto-c)、ROS表达及内质网应激蛋白(IRE1-α、ASK1、JNK)的mRNA及蛋白水平变化,以及使用线粒体裂变抑制剂Mdivi-1前后应激对线粒体融合蛋白(mfn1、mfn2、opa1)、裂变蛋白(Drp1~(ser616)、Drp1、fis1)、细胞色素c(Cyto-c)、ROS表达及内质网应激蛋白(IRE1-α、ASK1、JNK)的影响。3.HE染色、变色酸-2R-亮绿染色观察使用线粒体裂变抑制剂Mdivi-1后心肌细胞的病理形态学变化。结果:1.随着应激时间的延长,线粒体嵴发生肿胀、断裂,线粒体面积和周径明显减少,线粒体碎片化增多,线粒体明显损伤。2.随着应激时间的延长,线粒体融合蛋白表达降低而裂变蛋白明显增加,线粒体融合裂变紊乱,线粒体功能发生障碍,内质网应激IRE1α-ASK1-JNK损伤信号通路被明显激活。3.使用线粒体裂变抑制剂Mdivi-1能够明显的抑制线粒体裂变增加线粒体融合,显著缓解应激导致的线粒体融合裂变紊乱,线粒体的碎片化减少,线粒体损伤减轻。4.线粒体融合裂变再平衡能够显著抑制内质网应激IRE1α-ASK1-JNK损伤信号通路减轻心肌细胞损伤。小结:本部分研究表明:应激能够显著性增加线粒体裂变减少线粒体融合,线粒体融合裂变发生紊乱,线粒体功能发生障碍,同时内质网应激IRE1α-ASK1-JNK损伤信号通路被激活,心肌细胞发生损伤,应用线粒体裂变抑制剂Mdivi-1可减轻线粒体裂变状态,缓解内质网应激反应,减轻应激对心肌细胞的损伤。总之本部分研究表明应激诱导的线粒体融合裂变紊乱启动内质网应激参与了心肌细胞的损伤过程。在第三部分体外实验中将对上述结论进行进一步研究,探讨线粒体融合裂变紊乱启动内质网应激参与心肌细胞损伤的分子机制。第三部分ISO诱导H9C2心Liraglutide细胞培养肌细胞损伤的分子机制目的:在细胞水平通过异丙肾上腺素(ISO)模拟应激诱导心肌细胞损伤进一步深入探究线粒体融合裂变紊乱启动内质网应激参与心肌细胞损伤的分子机制。方法:1.体外培养大鼠来源的H9C2心肌细胞系,用ISO刺激H9C2心肌细胞;CCK8法检测H9C2心肌细胞活性。2.免疫荧光染色检测ISO对H9C2心肌Bafilomycin A1分子式细胞系骨架蛋白desmin表达的影响。3.免疫荧光染色检测使用抑制剂Mdivi-1前后线粒体融合蛋白(mfn1、mfn2、opa1)、裂变蛋白(drp1~(ser616)、drp1、fis1)、Cyto-c蛋白、ROS以及线粒体外膜转位酶复合体蛋白Tomm20的表达变化。4.免疫荧光染色检测使用抑制剂Mdivi-1前后内质网应激IRE1α-ASK1-JNK信号通路相关蛋白IRE1-α、ASK1、JNK的表达变化。结果:1.CCK8实验结果显示:12.5μM,25μM的ISO对细胞存活率没有影响,50μM(P<0.01),150μM(P<0.01),200μM(P<0.01)组细胞存活率明显降低;50μM ISO处理的H9C2心肌细胞在24 h,48 h及72 h细胞存活率明显降低(P<0.01)。2.ISO诱导的H9C2心肌细胞骨架蛋白desmin表达明显降低。3.ISO诱导的H9C2心肌细胞线粒体融合蛋白显著性减少,裂变蛋白显著性增加,线粒体功能发生紊乱,细胞内ROS显著增加,而使用Mdivi-1能够明显降低线粒体裂变增加线粒体融合,减轻线粒体功能障碍并使细胞内ROS水平显著降低。4.ISO诱导的H9C2心肌细胞内质网应激IRE1α-ASK1-JNK信号通路显著激活,而使用Mdivi-1能够抑制内质网应激信号通路。小结:本部分研究在细胞水平验证了ISO诱导H9C2心肌细胞发生线粒体融合裂变紊乱,线粒体功能障碍,细胞内ROS水平增高,进而激活内质网应激IRE1α-ASK1-JNK信号通路,参与心肌细胞的损伤过程。结论:本研究通过整体实验及细胞实验,采用组织病理学、分子生物学等技术对应激状态下引发心肌细胞损伤的分子机制进行了较系统的研究,得出以下结论:应激可致大鼠心肌细胞发生损伤,主要引发线粒体的融合、裂变紊乱从而启动内质网应激信号通路IRE1α-ASK1-JNK mRNA及蛋白表达的动态变化,提示其参与心肌细胞损伤过程;采用ISO诱导H9C2心肌细胞线粒体病理学改变,在细胞水平上进一步证实心肌细胞的损伤是在线粒体融合裂变紊乱的基础上,激活了内质网应激IRE1α-ASK1-JNK信号通路中mRNA及蛋白表达的动态变化,提示其是参与细胞损伤的重要分子机制。